第一部分临床研究双侧小耳畸形患者的听力干预目的:观察双侧先天性小耳畸形婴幼儿应用软带骨锚式助听器后的听觉发育情况,及对植入式骨锚助听器的改良术式和助听效果进行评估。方法:受试者为46名双侧先天性小耳畸形伴外耳道闭锁患者,将其分为两组。软带Ponto组为40名3个月至2岁的患儿,佩戴软带Ponto;植入Ponto组为6名6-28岁患者,行骨锚式助听器改良植入术式。软带Ponto组,应用中文版婴幼儿有意义听觉整合量表(IT-MAIS)对患者佩戴前、佩戴3个月、6个月、12个月及24个月进行听觉发育评估;应用视觉强化测听,在声场中测试患儿佩戴软带Ponto 6个月后裸耳和助听条件下的纯音听阈。植入Ponto组,应用颞骨高分辨CT评估外中耳的畸形程度,同时测量患者裸耳、佩戴软带Ponto及佩戴植入式Ponto时声场下的纯音听阈及言语识别率。结果:在软带Ponto组,IT-MAIS评分显示佩戴软带Ponto后患儿听觉发育水平较前明显提高且逐渐接近同龄水平;裸耳及佩戴软带Ponto条件时声场下的视觉强化测听结果分别为 76.75±6.05 dB SPL 和 32.25±6.20 dB SPL(P<0.01)。在植入Ponto组,5名患者行耳廓再造同期骨锚式助听器植入术,1名患者行双侧骨锚式助听器同期植入术;患者术后在裸耳、佩戴软带Ponto及佩戴植入Ponto时声场下的纯音听阈分别为 59.17±3.76 dB SPL,32.5±2.74 dB SPL 和 17.5±5.24 dB SPL(P<0.01);患者在裸耳、佩戴软带Ponto及佩戴植入Ponto时声场下的言语识别率分别为 23.33±14.72%,77.17±6.46%和 96.50±2.66%(P<0.01)。结论:软带及植入式骨锚助听器在促进双侧小耳畸形患者听觉发育及听力干预方面疗效显著。对于双侧小耳畸形婴幼儿我们建议尽早佩戴软带骨锚式助听器进行听力干预,待其年龄足够后选择耳廓再造同期听力植入改良术式,此策略可同时解决听力及外形问题,并且具有手术次数少和手术创伤小等优点。第二部分基础研究耳-下颌发育不全综合征家系致病基因的筛选和功能研究目的:探寻耳-下颌发育不全综合征家系的高危致病基因,并通过斑马鱼动物模型进行候选基因致病性的验证及发病机制的研究,为临床遗传咨询、产前诊断及基因治疗提供理论依据。方法:通过分析耳-下颌发育不全综合征家系的全外显子测序结果筛选高危致病基因。应用原位杂交技术探究候选基因在斑马鱼的时空表达谱。应用Morpholino及CRISPR/Cas9技术敲低和敲除候选基因的表达来观察斑马鱼颌面发育情况。采用阿尔新兰染色技术对斑马鱼颌面软骨进行染色以观察颌面软骨的形态结构。对颅面神经嵴细胞及咽囊发育各阶段标记基因进行原位杂交染色,探究候选基因在颌面软骨发育过程中的作用阶段。应用免疫荧光染色技术观察颅面神经嵴细胞的增殖及凋亡情况。结果:耳-下颌发育不全综合征家系全外显子测序结果筛选出VWA1高危致病基因,此突变为VWA1基因新发的非同义突变(Chr1:exon3:c.G905A:p.R302Q)。vwa1原位杂交结果示其在斑马鱼下颌区域特异性高表达。利用Morpholino及CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中敲低和敲除vwa1基因,均可得到颌面发育畸形的表型。阿尔新兰软骨染色结果示敲低和敲除vwa1基因,斑马鱼第一第二咽弓软骨形态及结构畸形,第三至七咽弓软骨结构消失。咽囊发育标记基因fgf3、tbx1、nkx2.3原位杂交结果示敲低vwa1基因,咽囊形态发生过程未受影响。颅面神经嵴细胞发育及分化的标记基因crestin、dlx2、sox9a、barx1、co12a原位杂交结果示敲低vwa1基因,颅面神经嵴细胞可进行迁移及分化,颅面神经嵴细胞的数量较野生型明显减少。免疫荧光染色结果示敲低vwa1基因,颅面神经嵴细胞的增殖明显减弱,凋亡未受影响。结论:VWA1基因为耳-下颌发育不全综合征的高危致病基因。在斑马鱼中敲低和敲除vwa1基因可导致斑马鱼颌面发育畸形。vwa1基因的低表达,可减少颅面神经嵴细胞的增殖,最终导致咽弓软骨发育畸形。