乳杆菌生产生物可降解聚酯单体的研究

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乳酸菌是能从可溶性碳水化合物发酵产生大量乳酸的一群细菌,它们无芽孢、不运动、革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性,根据糖代谢途径可将乳酸菌分为专性同型发酵、专性异型发酵和兼性异型发酵。目前乳酸菌已广泛应用于食品、医药保健、工业发酵、饲料等领域。其中,乳酸菌生产化工产品,特别是新型聚酯的单体的研究和应用越来越受到重视。1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是合成新型聚酯化学纤维PTT的单体,PTT具有强的生物可降解,是目前国际上合成纤维新品种开发的热点。近年来,利用微生物法生产1,3-PD在国内外都有较多报道,而乳酸菌生产1,3-PD的研究相对较少。作为食品级安全的乳酸菌,借助代谢工程技术过量生产1,3-PD具有潜在的可能性。本论文从腐败果酒中分离到一株能利用葡萄糖和甘油共发酵生产1,3-PD的乳杆菌。经过形态观察、生理生化和16S rRNA扩增产物专一性位点的酶切验证,鉴定该菌株为短乳杆菌(Lactobacillus brevis),命名为Lb.brevis W5-17。为了检测Lb.brevis W5-17产生1,3-PD的两个关键酶甘油脱水酶(glycerol dehydratase,GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol NAD+oxidoreductase,PDOR)活性,首先确定了超声波破碎菌体细胞的条件,其结果为:20mL发酵液离心后的菌体重悬于20mL的磷酸钾缓冲液(pH7.0),超声破碎6/7s,间歇4s,次数99,功率300w,细胞破碎率达到60-70%。在厌氧条件下,菌株Lb.brevis W5-17能利用分解葡萄糖过程中产生的还原力NADH,还原甘油生成1,3-PD。本论文对菌株Lb.brevis W5-17产生1,3-PD的发酵条件进行研究,由结果可知,当葡萄糖:甘油为0.05mol/L:0.1mol/L时,厌氧发酵70h可得1,3-PD 11.20mmol/L,甘油的转化率为0.30mol/mol,GDHt和PDOR的最大酶活性分别为0.84U/mL和3.80U/mL。此外,该菌株在有氧条件下也能生成1,3-PD,产量为7.12mmol/L,但其关键酶的活性较厌氧时低,此特性研究为代谢工程改造乳酸菌生产1,3-PD奠定了基础。L-乳酸是生产可降解聚酯乳酸PLA的单体,乳酸菌在生长过程中能产生大量乳酸。为了降低乳酸生产成本,本论文以玉米芯水解液为碳源发酵生产L-乳酸,以实现废弃生物质资源的高值化,进而维持自然界的碳平衡。玉米芯经盐酸水解后产生大量单糖,经液相色谱分析,D-木糖为72~78g/L,D-葡萄糖为10~12g/L,L-阿拉伯糖为9~11g/L。将实验室保藏的多株乳杆菌接种到玉米芯水解液中,培养后筛选得到一株能最大程度转化这三种单糖为L-乳酸的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum S34,并对Lactobacillus plantarum S34的代谢特点进行了研究。结果发现,将玉米芯水解液以1:4稀释后,发酵50h,L-乳酸的产量达9.0g/L,乙酸为2.9g/L,葡萄糖和阿拉伯糖的质量利用率为100%,木糖的质量利用率为29.4%。为了进一步提高对木糖的利用效率,对玉米芯水解液培养基的成分进行了优化,获得最佳培养基组成为(g/L):玉米芯水解液(1:4),大豆蛋白胨20,(NH42C6H5O7 2,K2HPO4 2,CaCO3 10,pH6.0。在此基础上,利用5L发酵罐发酵50h,L-乳酸和乙酸的终浓度分别为32.0g/L和14.6g/L。木糖的利用率由29.4%提高到39.0%,阿拉伯糖和葡萄糖几乎消耗完全。
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