目的： 建立快速鉴定国内常见角膜致病真菌的液相核酸芯片检测系统，优化反应条件并初步以该系统鉴定待测真菌的临床角膜分离菌株，进而对该系统进行验证和评估，探讨液相核酸芯片技术应用于真菌性角膜炎临床快速诊断的可行性。 方法： 1、根据国内真菌性角膜炎致病菌种分布，选取5种发病率较高的真菌菌种作为本研究的待测真菌。 2、根据检测需要和专家推荐选择7种不同色号的羧基化微球。 3、以沙堡氏培养基培养待测真菌的标准菌株5株和临床分离菌株42株，用离心柱法提取基因组DNA，以一对真菌通用引物扩增并纯化，生物素标记后的聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)产物用于杂交检测。所用真菌通用引物序列为：P1-5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，P2-5’-TCCTCCGCTTATT-GATATG-3’。 4、从Genebank获取所选5种真菌菌种的rRNA基因序列，将其与PCR产物测序所得序列以Clustal软件进行比对，根据比对结果应用Oligo6.65和Primerpremier5.0软件在真菌rRNA基因的内转录间隔区(intemaltranscribedspacerregion，ITS)序列中设计种特异性探针，通过Clustal和Blast比对筛选后5’端以氨基C12修饰合成。同时设计阳性及阴性质控探针作为实验对照。 5、5条检测探针和2条质控探针分别利用5’端的氨基修饰与7种色号微球表面的羧基形成共价交联，成为可以捕获目的DNA片段的检测分子。 6、选取4个可能对实验影响较显著的因素，即交联好的微球与PCR产物的杂交温度、杂交时间，抗生物蛋白链菌素-R-藻红蛋白的反应浓度以及反应时间，采用L9(34)正交设计实验对反应条件进行优化。 7、利用所制备的真菌诊断用液相芯片对42株临床分离菌株进行菌种鉴定，确定其检测灵敏度并与PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行比较。 8、用同一批次芯片同时对5种待测真菌进行4次重复检测，评估芯片的检测重复性。 结果： 1、选取茄病镰刀菌、串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌和黄曲霉菌作为本研究的待测真菌菌种，由其引起的角膜感染占我国真菌性角膜炎总发病率的80％左右。 2、根据公司的推荐及查阅资料选择3号、5号、7号、20号、35号、47号和79号羧基化微球。 3、5株标准菌株和42株临床分离菌株基因组DNA的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳均可见清晰、单一的电泳条带，片段大小位于500～600bp之间，将其纯化后测序，可见测序所得序列与从Genebank上查得的相应序列基本一致。 4、所设计的种特异性探针及质控探针的序列为： 茄病镰刀菌GCACACGCCGTCCCTCAAATAC 串珠镰刀菌TCGTTACTGGTAATCGTCGCGG 尖孢镰刀菌CTCAAGCCCTCGGGTTTGGTGT 烟曲霉菌CGCCAGCCGACACCCAACTTTA 黄曲霉菌TGCCGAACGCAAATCAATCT 阳性质控GCATATCAATAAGCGGAGGA 阴性质控TTTCAGATGATTCTCGGTTACTTGTGTC 5、正交设计优化的最佳反应条件为：交联微球与生物素化待测PCR产物在50℃避光杂交1小时，离心去上清后加入4μg/ml的抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白溶液75μL，避光孵育5分钟，取50μL用于Luminex100检测仪分析。 6、在上述优化条件下，所建立的液相芯片检测体系可准确将5株标准菌株和42株临床分离菌株鉴定至种的水平，除2株临床分离菌株因首次检测背景荧光强度过高、影响结果判定而经重复检测得以鉴定外，其余菌株标本均在PCR后1.5小时内一次检测成功，单次检测阳性率达95.2％；单一菌种检测和5种菌种平行检测的中位荧光强度无统计学差异(t=0.82，P＞0.05)；检测范围为188ng～0.94ngPCR产物，最低检测浓度比琼脂糖凝胶电泳低40倍；中位荧光强度的变化与PCR产物的量呈正相关(rs=0.74，P＜0.05)；检测重复性较好，四次重复检测的变异系数在1.8％～13.7％之间。 结论： 本实验建立并优化的液相核酸芯片检测系统可以在同一反应体系内快速将1至5种角膜常见致病真菌鉴定至种的水平，具有较高的灵敏度、特异性和重复性；但要将液相核酸芯片技术真正应用于临床多种真菌的鉴定仍然需要进一步解决近亲菌种的探针特异性、微球背景荧光的稳定性及数据的分析处理等相关问题。