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自然杀伤T细胞(Nature killer T cell,NKT)是在T淋巴细胞发育早期中出现的特殊类型的T淋巴细胞亚群。既往研究发现NKT细胞在机体微环境免疫调节,肿瘤发生、自身免疫性疾病及多种皮肤科疾病的发生中具有重要作用。NKT细胞表现出T细胞和自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK)的特性,在功能上NKT细胞具有T细胞免疫调节功能,同时又兼具NK细胞的自然杀伤作用。NKT细胞是沟通天然免疫和获得性免疫之间的桥梁,但对于NKT细胞发育成熟的调控机制的认识尚不清晰。microRNA是新发现的一类内源性的短链编码单链RNA分子,长度约22碱基(nt),可以通过与靶基因特异性相互作用在转录后水平对靶mRNA进行降解、翻译抑制发挥着重要的生物学作用。microRNA参与免疫细胞的产生,发育和分化,并影响免疫细胞的功能。本课题组前期研究发现,敲除小鼠造血干细胞系Dicer裂解酶,造成小鼠造血系统缺乏成熟microRNAs,继而发现胸腺细胞中NKT细胞的发育和成熟明显受到抑制,但传统T细胞不受明显影响。目前关于microRNA在NKT细胞发育中作用的研究甚少,尚无单个microRNA对NKT细胞发育的相关研究。基于本课题组先前的研究基础,为继续深入探究单个microRNA在NKT细胞发育及功能的作用,课题组使用流式细胞分选仪分选不同发育阶段NKT细胞,通过microarray技术分析在不同发育阶段的NKT中microRNAs的表达变化,发现miR155和miR223特异性高表达于NKT细胞发育不成熟阶段(阶段1 CD44 lowNK1.1-和阶段2 CD44highNK1.1-),而在成熟阶段(阶段3 CD44highNK1.1+)表达明显降低。这些结果推测miR155和miR223可能对NKT细胞的发育成熟,并可能影响了细胞的功能,但目前缺乏确凿的实验证据。研究目的与方法为探究miR155和miR223在NKT细胞发育成熟和功能中的作用,本课题以miR223敲除(KO)小鼠,miR155敲除(KO)小鼠和造血干细胞特异性miR155转基因(KI)小鼠为研究对象,观察在特异性改变miR155及miR223表达水平的情况下,NKT细胞的发育成熟以及其功能是否出现异常变化。使用装载了α-GalCer的CD1d四聚体(α-GalCer-CD1d tetramers)的特异性抗体标记NKT细胞,应用流式细胞仪检测NKT细胞在不同淋巴器官中的数目,同时检测NKT细胞成熟细胞标记物表达水平。分别使用α-GalCer体内注射或PMA/Ionomycin体外刺激NKT细胞,检测NKT细胞分泌细胞因子的功能。研究结果1)在miR223KO小鼠模型中,NKT细胞发育成熟与功能的变化研究结果显示,与野生型(WT)小鼠相比,在miR223 -/Y KO小鼠中传统型T细胞各细胞亚群的比率为发生明显改变,miR223 -/Y KO小鼠与WT小鼠CD4+细胞亚群所占比率分别为10.56% vs.11.35%,CD8+细胞亚群5.02% vs. 5.71%,CD4+CD8+双阳性占81.60% vs. 80.65%,CD4-CD8-双阴性所占比率2.83% vs. 2.30%。胸腺、脾脏、肝脏、外周淋巴结及骨髓中NKT细胞的数目未发生明显变化(胸腺:0.15±0.02% vs. 0.15±0.01%,P=0.805,脾脏:0.80±0.14% vs. 0.73±0.13%,P=0.715,肝脏:14.67±3.51% vs. 13.37±2.83%,P=0.764,外周淋巴结:0.12±0.05% vs. 0.14±0.03%, P=0.557,骨髓:0.99±0.44% vs. 1.71±0.58%, P=0.376)。在NKT细胞三个发育成熟阶段中,包括阶段1 CD44lowNK1.1-、阶段2 CD44highNK1.1-及阶段3 CD44highNK1.1+,WT小鼠中胸腺NKT细胞与miR223 -/Y敲除小鼠相比,在三个发育阶段各占的比率在阶段1为5..59±0.92% vs.6.57±2.32%,P=0.781,在阶段2分别为15.59±4.44% vs. 13.08±2.39%,P=0.593,在阶段3的NKT细胞分别为77.83±4.69% vs. 78.71±3.85%,P=0.894。;NKT细胞成熟细胞表面标记物(包括Ly49G2,CD69,CD24及CD122)的表达均无明显异常。在外周淋巴器官中也观察到了同样的结果,NKT细胞中NK1.1+的比率无明显差异。经α-GalCer体内注射以及PMA/Ionomycin体外刺激NKT细胞,miR223 -/Y敲除小鼠NKT细胞分泌细胞因子(IL-4、IFN-γ)与野生型小鼠相比未发现明显异常。2)在miR155KO小鼠模型中,NKT细胞发育成熟与功能的变化在miR155敲除小鼠各个淋巴器官中NKT细胞数目不发生明显变化,野生型小鼠与miR155KO小鼠相比,胸腺NKT细胞所占比率为0.32±0.02% vs. 0.30±0.04%,P=0.745。脾脏NKT细胞占B220阴性细胞的0.83±0.12% vs. 0.83±0.13%,P=0.987。肝脏NKT细胞占B220阴性细胞的17.19±2.35% vs. 11.63±1.26%,P=0.694。miR155敲除小鼠胸腺中NKT细胞的发育正常,miR155敲除小鼠中胸腺NKT细胞在三个发育阶段各占的比率与野生小鼠中胸腺NKT细胞相比无明显差异。野生型(WT)小鼠microRNA155-/-小鼠在三个发育阶段各占的比率在阶段1分别为12.94±2.90% vs.12.73±3.49%,P=0.965,在阶段2分别为17.36±2.12% vs. 14.88±2.23%,P=0.439,在阶段3的NKT细胞分别为63.53±6.54% vs. 64.94±6.75%,P=0.894。两者之间无显著差异。NKT细胞成熟细胞表面标记物的表达均无明显异常。在外周淋巴器官中NKT细胞的进一步成熟也未出现异常,NK1.1阳性NKT细胞的比率无明显差异。3)在造血干细胞特异性miR155KI小鼠中,NKT细胞发育成熟与功能的变化与WT小鼠相比,miR155KI小鼠胸腺、脾脏、肝脏、外周淋巴结及骨髓中NKT细胞的数目未发生明显变化。野生型小鼠与miR155KI小鼠相比,胸腺NKT细胞所占比率为0.17±0.04% vs. 0.20±0.04%,P=0.616。脾脏NKT细胞占B220阴性细胞的0.85±0.14% vs. 0.66±0.10%,P=0.314。肝脏NKT细胞占B220阴性细胞的18.70±4.53% vs. 15.31±2.08%,P=0.522。淋巴结中NKT细胞占B220阴性细胞的0.16±0.03% vs. 0.19±0.02%,P=0.464。在各个淋巴器官中,NKT细胞的比率未发现存在明显统计学差异。在miR155KI小鼠胸腺内NKT细胞发育阻滞在阶段2即CD44highNK1.1-阶段,缺少成熟NKT细胞。野生型小鼠与miR155KI小鼠胸腺NKT细胞在三个发育阶段1分别为6.56±1.29% vs.13.01±2.91%,P=0.077,在阶段2分别为21.43±6.65% vs. 63.82±5.10%,P<0.001,在阶段3的NKT细胞分别为69.03±9.37% vs. 15.93±2.59%,P<0.001。与野生型小鼠相比,在miR155KI小鼠胸腺内NKT细胞发育阻滞在阶段2即CD44highNK1.1-阶段,缺少成熟NKT细胞,NKT细胞发育成熟明显滞后。miR155KI小鼠的胸腺中NKT细胞成熟细胞标记物表达水平降低。NKT细胞表达分子CD122、CD6、LY49C阳性比率分别为15.69±4.12%、26.25±3.87%、4.43±1.45%,均分别低于WT小鼠(71.59±5.03%、64.42±4.07%,38.03±3.44%),统计学差异显著(P<0.0001)。miR155KI小鼠的在外周淋巴器官中NKT细胞中表面成熟标记NK1.1的表达均显著低于同窝的野生型小鼠,NKT细胞的成熟也明显阻滞。在4~6周龄miR155KI小鼠中NKT细胞的增殖和凋亡比率均显著增加。经α-GalCer体内注射后,与野生型小鼠相比,miR155小鼠NKT细胞分泌的细胞内因子IL-4(34.73% vs. 9.09%)及IFN-γ(47.94% vs. 16.51%)水平明显降低;但经PMA/Ionomycin体外刺激NKT细胞,可以可恢复NKT细胞分泌IL4的水平(60.00% vs. 55.55%);miR155KI小鼠IFN-γ水平显著降低(70.00% vs. 39.00%)。研究结论:1)miR223的缺失不影响NKT细胞在胸腺及外周淋巴器官的发育成熟,同时NKT细胞的功能不受明显影响。2)miR155的缺失也不影响NKT细胞的发育成及功能。3)miR155的增加会显著影响NKT细胞发育,导致成熟明显滞后。并且可以显著降低NKT的功能及其细胞因子的分泌表达,分泌轴偏向Th2类细胞因子。基于目前我们的研究结果,miR155和miR223的缺失并不会影响NKT细胞在胸腺内的发育成熟,也不影响NKT细胞在外周淋巴器官的发育,同时NKT细胞的功能不受明显影响。但并不表示miR155和miR223不具有调节NKT细胞发育成熟的功能。miR155在NKT细胞成熟阶段的表达迅速降低,这是NKT细胞发育成熟所必须的过程。如在NKT细胞发育过程中miR155的表达未能降低,其靶基因表达无法正常表达,会明显影响NKT细胞的成熟及具备功能。