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肠激酶(enterokinase, EK)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,可沿胰蛋白酶原序列中(Asp)4 –Lys的羧基端切下，从而释放出活性胰蛋白酶。正是肠激酶在体内表现出的这种高度的酶切特异性使其成为当前基因工程领域融合蛋白表达后切割与纯化的重要工具之一。较之目前裂解融合蛋白常用的凝血酶、Xa因子等蛋白酶和溴化氰、羟胺等化学试剂,肠激酶具有非特异性切割极少，反应条件宽泛，切割位点在全部识别序列之后，切出的目标产品首位氨基酸可完全忠实于天然蛋白等特点。本文首次对中国北方黄牛肠激酶基因催化亚基（EKL）编码序列的cDNA进行了克隆并分别在大肠杆菌与毕赤酵母中实现了表达，得到如下结果：首先从市售中国北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段，将此片段克隆于pGEM?-T Easy载体中，经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后，进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致，得到了编码正确的牛Enterokinase催化亚基基因全序列。然后利用基因重组技术将编码牛EKL的基因片段插入pET39b融合型表达载体，转化到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）pLysS中，首次用融合的方式在原核系统中成功表达了带（His）8亲和标记的重组肠激酶催化亚基。经条件优化后，重组肠激酶催化亚基融合蛋白DsbA-EKL-（His）8可溶性表达量占裂菌上清总蛋白的18%以上。经镍亲和层析分离纯化后自催化切割产生的rEKL-（His）8达3.5mg/g湿菌，比活力1.34×107U/mg。与此同时，本文利用毕赤酵母表达系统对EKL基因编码序列进行了在真核细胞中的表达。将目的基因克隆到穿梭质粒pPIC9中，线性化后转染酵母Pichia pastoris，使之获得了分泌表达，表达量占培养液上清的32.8%。经大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）亲和层析纯化后得到活性rEKL 10.9ug/mL发酵液，酶的比活力2.88×107U/mg。本文还首次将融合蛋白DsbA-EKL-（His）8的自催化切割与酶解融合蛋白Trx-IL-11的过程偶联，酶切体系经一步镍亲和层析后rhIL-11纯度大于95%，为融合蛋白后处理工艺构建了一个崭新的技术平台，是我国生物制药领域在融合表达基因工程产品这一研究方向的先期工作。