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研究背景
脑积水是神经科常见疾病，是出血性卒中的常见并发症，也是患者预后不良的独立危险因素。除出血性卒中外还有脑膜炎、脑外伤等多种神经系统相关疾病会导致脑积水的发生，从婴幼儿到老年人影响人群广泛。但目前脑积水的内科治疗手段较为有限，外科手术治疗会伴随有癫痫、感染等并发症。所以深入探讨理解脑积水的发生机制十分重要，这将为临床治疗脑积水提供可行性方案。
脉络丛是产生脑脊液的主要器官，在脑积水的发生中扮演了十分重要的角色。脉络丛在参与脑脊液分泌的同时，其相关炎症反应及脉络丛巨噬细胞的免疫调节功能也日益受到关注，脉络丛炎症反应与多种神经系统疾病相关。脉络丛巨噬细胞是一种独特来源的大脑非实质区巨噬细胞，具备胚胎前体细胞及成年造血系统前体细胞的双重来源，是中枢神经系统重要的免疫门户，是参与脉络丛炎症反应的重要组成部分。但脉络丛相关炎症反应，特别是脉络丛巨噬细胞在脑积水中的具体作用并不清楚。
本研究将利用侧脑室注射凝血酶和自发高血压大鼠两种动物模型模拟脑积水的发生。重点观察不同模型下脑积水的发生发展过程及脉络丛变化，探讨不同模型中脑积水的发生机制及干预策略。
第一部分凝血酶诱导大鼠脑积水形成模型中脉络丛相关炎症反应的作用及干预策略
研究目的
凝血酶在脑出血继发脑损伤中发挥了重要作用，但其在脑积水中的作用还不明确。该研究将进一步探讨脉络丛相关炎症反应在凝血酶诱导大鼠脑积水中的作用及其干预策略。
研究方法
1.采用侧脑室注射凝血酶的方法模拟脑室出血后脑积水发生。成年SD大鼠被随机分为两组，分别给予相同体积的生理盐水或凝血酶侧脑室注射。24小时后采用核磁共振成像(Magneticresonanceimage，MRI)方法测量侧脑室体积。使用HE染色及免疫荧光染色观察脉络丛炎症细胞浸润及脉络丛巨噬细胞变化。用Evansblue染料含量测定和白蛋白免疫组织化学染色的方法检测大鼠脑屏障渗透性。并采用蛋白免疫印迹和免疫荧光染色的方法观察脉络丛中连接蛋白的变化情况。
2.给予凝血酶受体(Protease-activated receptor1，PAR1)拮抗剂SCH79797观察其在凝血酶诱导脑积水中的作用及其对脉络丛的影响。将成年SD大鼠侧脑室注射凝血酶后随机分组，分别给予PAR1拮抗剂(SCH79797)，以及PAR1下游效应因子Src抑制剂(PP2)、PAK1抑制剂(IPA3)。通过核磁共振、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹等方法观察大鼠脑室大小，脉络丛巨噬细胞变化及细胞连接相关蛋白的变化情况。
研究结果
1.与注射相同体积生理盐水相比，大鼠侧脑室注射凝血酶24小时后，MRI发现大鼠脑室体积明显扩大；脉络丛炎症细胞浸润增多，脉络丛巨噬细胞活化(CD68阳性细胞)明显增加；脑组织中Evansblue含量增加，免疫组织化学结果提示脉络丛周围白蛋白沉积增多，蛋白免疫印迹结果发现脉络丛组织中血管内皮钙连蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)显著减少。
2.大鼠侧脑室注射凝血酶的同时，分别随机给予PAR1拮抗剂(SCH79797)、Src抑制剂(PP2)、PAK1抑制剂(IPA3)治疗。24小时后观察发现，SCH79797治疗组缓解了大鼠脑积水的发生，减少了脉络丛巨噬细胞CD68阳性细胞数量，一定程度上逆转了脉络丛中VE-cadherin的减少；PP2和IPA3也不同程度的缓解了凝血酶注射后脑室体积扩大，逆转脉络丛中VE-cadherin的减少。
结论
1.侧脑室注射凝血酶可以导致脉络丛炎症浸润、脉络丛巨噬细胞激活，血脑屏障及血脑脊液屏障破坏，脉络丛连接蛋白VE-cadherin减少，诱导大鼠脑积水的产生。
2.PAR1拮抗剂(SCH79797)可以减少脉络丛巨噬细胞激活及脉络丛中连接蛋白VE-cadherin的破坏，缓解大鼠脑积水的发生；Src抑制剂(PP2)和PAK1抑制剂(IPA3)也不同程度的缓解了大鼠脑积水的发生；SCH79797可以通过抑制PAR1-Src-PAK1通路逆转脉络丛中VE-cadherin的减少。
第二部分自发高血压大鼠脑积水形成中脉络丛巨噬细胞激活的作用及干预策略
研究目的
明确自发高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHRs)脑积水发生发展规律，着重研究脉络丛相关炎症反应中脉络丛巨噬细胞变化对SHRs脑积水影响，并探讨SHRs脑积水治疗策略。
研究方法
1.取同周龄同性别WKY(Wistar-Kyoto)大鼠与自发高血压大鼠进行对照。MRI分别于不同时间点观察大鼠侧脑室大小。采用免疫组织化学染色的方法观察脉络丛巨噬细胞(Iba1)及其激活(CD68)情况的变化。为了进一步观察脑积水继发脑损伤的情况，实验采用新事物识别的行为学方法评价了SHRs脑积水发生后的认知功能。并采用HE组织染色的方法观察不同大鼠的胼胝体厚度，采用免疫荧光的方法观察海马CA1区神经元数量。
2.在脑积水发生初期将雄性SHRs随机分组，治疗组给予去铁敏或米诺环素腹腔注射；对照组给予相同体积的生理盐水。用核磁共振的方法观察大鼠侧脑室变化情况，并采用免疫组织化学的方法观察脉络丛巨噬细胞变化及激活情况。通过行为学评分检测认知功能障碍，并用免疫组织化学的方法观察SHRs治疗组和对照组的神经元丢失及胼胝体区的变化。
研究结果
1.与同周龄同性别WKY大鼠相比，七周龄SHRs已经发生明显的脑积水。九周龄SHRs脑积水进一步加重，且雄性SHRs比雌性SHRs脑积水程度更为严重。免疫组织化学染色的结果发现，与WKY大鼠相比，九周龄SHRs脉络丛巨噬细胞CD68阳性细胞明显增多。同时发现与WKY大鼠相比，九周龄SHRs胼胝体厚度变薄，海马CA1区神经元NeuN数量减少，且伴随有认知功能受损。而脑积水发生前(四周龄时)的免疫组织化学结果提示，SHRs在脑积水出现前已经发生脉络丛巨噬细胞胞体变大及激活的CD68阳性细胞数量的显著增加。
2.米诺环素治疗组相比较于对照组缓解了SHRs脑积水的发生；减少了激活的脉络丛巨噬细胞CD68细胞数量；改善了认知功能障碍，减轻了胼胝体萎缩及海马CA1区神经元丢失情况。同时监测大鼠的一般生理状况发现，米诺环素在一定程度上缓解了SHRs高血压，但并未出现体重下降等不良反应。而去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水的发生。
结论
1.脉络丛相关炎症反应是SHRs脑积水发生的重要因素，且脉络丛巨噬细胞激活与脑积水严重程度呈显著正相关。九周龄SHRs相比较于WKY大鼠发生明显的脑积水，同时伴随有认知功能障碍及白质损伤和神经元丢失。
2.在SHRs脑积水发生后给予米诺环素可以通过抑制脉络丛巨噬细胞激活延缓脑积水进展，改善认知功能，减轻白质损伤和神经元丢失。而去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水的发生，也提示米诺环素治疗SHRs脑积水并不是通过螯合铁离子发挥作用的。
脑积水是神经科常见疾病，是出血性卒中的常见并发症，也是患者预后不良的独立危险因素。除出血性卒中外还有脑膜炎、脑外伤等多种神经系统相关疾病会导致脑积水的发生，从婴幼儿到老年人影响人群广泛。但目前脑积水的内科治疗手段较为有限，外科手术治疗会伴随有癫痫、感染等并发症。所以深入探讨理解脑积水的发生机制十分重要，这将为临床治疗脑积水提供可行性方案。
脉络丛是产生脑脊液的主要器官，在脑积水的发生中扮演了十分重要的角色。脉络丛在参与脑脊液分泌的同时，其相关炎症反应及脉络丛巨噬细胞的免疫调节功能也日益受到关注，脉络丛炎症反应与多种神经系统疾病相关。脉络丛巨噬细胞是一种独特来源的大脑非实质区巨噬细胞，具备胚胎前体细胞及成年造血系统前体细胞的双重来源，是中枢神经系统重要的免疫门户，是参与脉络丛炎症反应的重要组成部分。但脉络丛相关炎症反应，特别是脉络丛巨噬细胞在脑积水中的具体作用并不清楚。
本研究将利用侧脑室注射凝血酶和自发高血压大鼠两种动物模型模拟脑积水的发生。重点观察不同模型下脑积水的发生发展过程及脉络丛变化，探讨不同模型中脑积水的发生机制及干预策略。
第一部分凝血酶诱导大鼠脑积水形成模型中脉络丛相关炎症反应的作用及干预策略
研究目的
凝血酶在脑出血继发脑损伤中发挥了重要作用，但其在脑积水中的作用还不明确。该研究将进一步探讨脉络丛相关炎症反应在凝血酶诱导大鼠脑积水中的作用及其干预策略。
研究方法
1.采用侧脑室注射凝血酶的方法模拟脑室出血后脑积水发生。成年SD大鼠被随机分为两组，分别给予相同体积的生理盐水或凝血酶侧脑室注射。24小时后采用核磁共振成像(Magneticresonanceimage，MRI)方法测量侧脑室体积。使用HE染色及免疫荧光染色观察脉络丛炎症细胞浸润及脉络丛巨噬细胞变化。用Evansblue染料含量测定和白蛋白免疫组织化学染色的方法检测大鼠脑屏障渗透性。并采用蛋白免疫印迹和免疫荧光染色的方法观察脉络丛中连接蛋白的变化情况。
2.给予凝血酶受体(Protease-activated receptor1，PAR1)拮抗剂SCH79797观察其在凝血酶诱导脑积水中的作用及其对脉络丛的影响。将成年SD大鼠侧脑室注射凝血酶后随机分组，分别给予PAR1拮抗剂(SCH79797)，以及PAR1下游效应因子Src抑制剂(PP2)、PAK1抑制剂(IPA3)。通过核磁共振、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹等方法观察大鼠脑室大小，脉络丛巨噬细胞变化及细胞连接相关蛋白的变化情况。
研究结果
1.与注射相同体积生理盐水相比，大鼠侧脑室注射凝血酶24小时后，MRI发现大鼠脑室体积明显扩大；脉络丛炎症细胞浸润增多，脉络丛巨噬细胞活化(CD68阳性细胞)明显增加；脑组织中Evansblue含量增加，免疫组织化学结果提示脉络丛周围白蛋白沉积增多，蛋白免疫印迹结果发现脉络丛组织中血管内皮钙连蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)显著减少。
2.大鼠侧脑室注射凝血酶的同时，分别随机给予PAR1拮抗剂(SCH79797)、Src抑制剂(PP2)、PAK1抑制剂(IPA3)治疗。24小时后观察发现，SCH79797治疗组缓解了大鼠脑积水的发生，减少了脉络丛巨噬细胞CD68阳性细胞数量，一定程度上逆转了脉络丛中VE-cadherin的减少；PP2和IPA3也不同程度的缓解了凝血酶注射后脑室体积扩大，逆转脉络丛中VE-cadherin的减少。
结论
1.侧脑室注射凝血酶可以导致脉络丛炎症浸润、脉络丛巨噬细胞激活，血脑屏障及血脑脊液屏障破坏，脉络丛连接蛋白VE-cadherin减少，诱导大鼠脑积水的产生。
2.PAR1拮抗剂(SCH79797)可以减少脉络丛巨噬细胞激活及脉络丛中连接蛋白VE-cadherin的破坏，缓解大鼠脑积水的发生；Src抑制剂(PP2)和PAK1抑制剂(IPA3)也不同程度的缓解了大鼠脑积水的发生；SCH79797可以通过抑制PAR1-Src-PAK1通路逆转脉络丛中VE-cadherin的减少。
第二部分自发高血压大鼠脑积水形成中脉络丛巨噬细胞激活的作用及干预策略
研究目的
明确自发高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHRs)脑积水发生发展规律，着重研究脉络丛相关炎症反应中脉络丛巨噬细胞变化对SHRs脑积水影响，并探讨SHRs脑积水治疗策略。
研究方法
1.取同周龄同性别WKY(Wistar-Kyoto)大鼠与自发高血压大鼠进行对照。MRI分别于不同时间点观察大鼠侧脑室大小。采用免疫组织化学染色的方法观察脉络丛巨噬细胞(Iba1)及其激活(CD68)情况的变化。为了进一步观察脑积水继发脑损伤的情况，实验采用新事物识别的行为学方法评价了SHRs脑积水发生后的认知功能。并采用HE组织染色的方法观察不同大鼠的胼胝体厚度，采用免疫荧光的方法观察海马CA1区神经元数量。
2.在脑积水发生初期将雄性SHRs随机分组，治疗组给予去铁敏或米诺环素腹腔注射；对照组给予相同体积的生理盐水。用核磁共振的方法观察大鼠侧脑室变化情况，并采用免疫组织化学的方法观察脉络丛巨噬细胞变化及激活情况。通过行为学评分检测认知功能障碍，并用免疫组织化学的方法观察SHRs治疗组和对照组的神经元丢失及胼胝体区的变化。
研究结果
1.与同周龄同性别WKY大鼠相比，七周龄SHRs已经发生明显的脑积水。九周龄SHRs脑积水进一步加重，且雄性SHRs比雌性SHRs脑积水程度更为严重。免疫组织化学染色的结果发现，与WKY大鼠相比，九周龄SHRs脉络丛巨噬细胞CD68阳性细胞明显增多。同时发现与WKY大鼠相比，九周龄SHRs胼胝体厚度变薄，海马CA1区神经元NeuN数量减少，且伴随有认知功能受损。而脑积水发生前(四周龄时)的免疫组织化学结果提示，SHRs在脑积水出现前已经发生脉络丛巨噬细胞胞体变大及激活的CD68阳性细胞数量的显著增加。
2.米诺环素治疗组相比较于对照组缓解了SHRs脑积水的发生；减少了激活的脉络丛巨噬细胞CD68细胞数量；改善了认知功能障碍，减轻了胼胝体萎缩及海马CA1区神经元丢失情况。同时监测大鼠的一般生理状况发现，米诺环素在一定程度上缓解了SHRs高血压，但并未出现体重下降等不良反应。而去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水的发生。
结论
1.脉络丛相关炎症反应是SHRs脑积水发生的重要因素，且脉络丛巨噬细胞激活与脑积水严重程度呈显著正相关。九周龄SHRs相比较于WKY大鼠发生明显的脑积水，同时伴随有认知功能障碍及白质损伤和神经元丢失。
2.在SHRs脑积水发生后给予米诺环素可以通过抑制脉络丛巨噬细胞激活延缓脑积水进展，改善认知功能，减轻白质损伤和神经元丢失。而去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水的发生，也提示米诺环素治疗SHRs脑积水并不是通过螯合铁离子发挥作用的。