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谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase）,可以通过酰基转移反应使蛋白质或多肽之间发生共价交联,在食品加工、生物医药、纺织业和皮革加工等领域均有广泛的应用。随着TGase需求量的增加,实现活性TGase的高效表达成为研究热点。本研究将茂源链霉菌（Streptomyces mobaraense）TGase表达于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）,通过酶原区替换、酶原区与成熟区之间插入Kex2酶识别位点、共表达酶原与活化蛋白酶等策略实现了活性TGase的高效表达。此外通过定点突变提高了其比酶活和催化活性。主要结果如下:（1）pro-TGase在Y.lipolytica Po1h中的高效表达将S.mobaraense TGase酶原（mpro-TGase,酶原区为mpro）克隆至表达载体p INA1297,得到重组质粒pINA1297/mpro-TGase。该质粒转化Y.lipolytica Po1h,得到重组Y.lipolytica Po1h/mpro-TGase。经dispase活化,Y.lipolytica Po1h/mpro-TGase胞内外TGase酶活分别仅为1.25 U·m L-1和0.11 U·m L-1。在pINA1297/mpro-TGase基础上,将mpro-TGase中的mpro基因替换为吸水链霉菌酶原区（hpro）基因,得到重组Y.lipolytica Po1h/hpro-TGase。摇瓶发酵结果显示,其胞外酶活可达11.69 U·mL-1,较出发菌Y.lipolytica Po1h/mpro-TGase提高106倍。3 L罐分批发酵酶活达到41.21 U·m L-1。转录水平分析发现,相同拷贝数下hpro-TGase的转录水平较mpro-TGase明显提高。上述结果表明,酶原区对TGase在Y.lipolytica中的分泌表达有重要影响。定点突变分析显示,酶原区N-端前两个氨基酸是影响TGase在Y.lipolytica中表达的关键氨基酸。（2）TGase在Y.lipolytica Po1h中的活性表达基于pINA1297/hpro-TGase,通过在hpro与成熟区TGase之间插入宿主Kex2蛋白酶识别位点（策略1）和共表达hpro-TGase与谷氨酰胺转氨酶激活金属蛋白酶（Transglutaminase activating metalloprotease,TAMEP）（策略2）,使hpro-TGase在Y.lipolytica中表达后被切除酶原区,而直接转化为活性TGase。摇瓶发酵结果显示,策略1和策略2构建得到的重组菌的TGase产量分别为5.26 U·mL-1和6.77 U·m L-1。酶学性质研究表明,策略1和策略2得到的重组菌的TGase比酶活、Km及kcat/Km均明显优于S.mobaraensis TGase。（3）定点突变提高TGase的催化活性为提高TGase的催化活性,本研究通过Discovery Studio 2017预测了S.mobaraense TGase中影响其与底物α-N-CBZ-GLN-GLY结合自由能的氨基酸位点,并构建得到了结合自由能下降的TGase突变体:Y24W、R89W、E300W和Y302R。结果显示,与野生TGase相比,E300W的比酶活提高了31%;Km、kcat和kcat/Km值分别提高了10%、42%和29%,说明E300W比酶活的提高主要是由于酶转换数的增加。Y24W、R89W、E300W和Y302R的热稳定性均有不同程度下降。作用力分析发现,疏水相互作用和离子间相互作用是影响TGase热稳定性的主要原因。上述结果表明,基于蛋白质结合自由能分析的策略能迅速鉴定影响TGase催化活性关键氨基酸,进一步突变能有效提高其催化活性。