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脂肪酸(FAs)是构成大多数细胞脂质的基本成分,在生物体的整个生命过程中都是必不可少的。在高等植物中,脂肪酸生物合成发生在质体中,随后大部分被转运至内质网进行进一步修饰及脂质组装。然而,质体脂肪酸的运输机制尚未阐明。油菜是世界范围内重要的油料作物,植物油脂是重要的食用油,也是潜在的可再生生物质能源。质体产生以及转运脂肪酸的含量限制着油料作物种子中三酰甘油(TAG)的组装,通过增加脂肪酸生物合成的通量可能对植物组织TAG的积累产生较大的影响。因此,研究揭示油菜脂肪酸转运的分子调控机制有着重要的理论意义和经济价值。本文从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中分离鉴定了一个拟南芥脂肪酸转运蛋白AtFAX1的同源蛋白基因,命名为Bn3662。通过对该基因表达、蛋白定位及功能等方面的研究,试图探讨揭示Bn3662在油菜脂肪酸转运中的作用及其相关的分子调控机制。所取得的主要研究结果概述如下:1.Bn3662分子鉴定及在油菜组织中的表达分析序列比对和系统进化分析表明,甘蓝型油菜脂肪酸转运蛋白Bn3662与拟南芥AtFAX1具有高度同源性。通过拓扑学预测分析Bn3662为跨膜蛋白,具有四个跨膜结构域,且含有一个由55个氨基酸残基组成的叶绿体转运肽前导序列,初步推测其可能定位于叶绿体。构建35S-eGFP-Bn3662表达载体,转化农杆菌细胞,注射烟草叶片下表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察GFP荧光信号,证实Bn3662蛋白定位于细胞的叶绿体中。利用实时定量RT-PCR技术对Bn3662在油菜组织中的表达情况进行分析,结果显示,Bn3662在开花授粉后25天的种子中表达量最高。分析Bn3662在亲缘关系较近但含油量有显著差异的两个油菜品种(HFA和LFA)发育15、20、25、30、40和50天(DAP)的种子中的表达情况,结果表明Bn3662在油脂合成高峰期的25 DAP种子中高表达。而且,该基因在高含油量品种HFA中的表达量更高,这说明Bn3662可能影响油菜种子及其他组织器官的油脂合成。2.Bn3662促进油菜叶片中脂肪酸合成构建了35S-Flag-Bn366 过量表达载体,通过农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法获得转基因油菜植株。分析表明,过量表达Bn3662转基因油菜叶片中脂肪酸含量明显高于野生型。而且,脂肪酸组分分析发现,Bn3662转基因油菜叶片中软脂酸C16:0、硬脂酸C18:0和油酸C18:1等不饱和度低的脂肪酸比率增加,而C16:1、亚油酸C18:2和亚麻酸C18:3等不饱和度高的脂肪酸比率下降。这说明过量表达Bn3662会促进质体内脂肪酸运输,导致脂肪酸从质体合成后向外流动增快,因而叶片总脂肪酸含量明显增加。3.Bn3662影响糖酵解和脂肪酸及油脂合成途径相关酶基因的表达植物油脂合成涉及到一系列多环节生化反应,包括糖酵解途径、脂肪酸合成及脂质组装等过程。为探讨Bn3662对油菜细胞油脂合成过程的影响,利用荧光实时定量RT-PCR技术分析了糖代谢途径中的关键酶基因、脂肪酸合成相关基因和三酰甘油组装相关酶基因的表达水平。结果表明,相比野生型油菜,在过量表达Bn3662转基因油菜中这些关键酶基因的表达量均上调,说明过量表达Bn3662影响脂肪酸合成及三酰甘油组装过程相关酶基因的表达,从而促进油菜细胞内的脂肪酸和油脂的生物合成和积累。4.Bn366 参与调控油菜开花诱导相关基因的表达对Bn3662过量表达转基因油菜表型观察发现,与野生型相比,Bn3662过量表达转基因油菜表现出明显的早花表型(提前30-45天开花)。而且,组织表达分析也显示,Bn3662在油菜植株的花器官中高水平表达。分析了调控植物开花相关基因的表达,结果表明,在Bn3662过量表达转基因油菜中,调控开花时间的基因FT、TSF、LFY、SOC1、AG和AP3的表达量明显上升。这些基因皆属于开花整合基因,是多条成花诱导信号调控途径的下游靶基因,其表达是通过何种方式被直接影响或是间接影响的,还需要进一步的探究分析。同时,为排除因开花时间差异影响生育期,从而对种子含油量的研究产生影响,构建了种子特异启动子BnNapinP-Bn3662进行油菜转化,相关的研究还在进行中。5.Bn3662与BnPP2C相互作用构建了pGBKT7-Bn3662载体,转化酵母Y187菌株,利用酵母双杂交技术,在油菜开花授粉后25天(25DAP)种子的cDNA文库中筛选其相互作用蛋白。获得一些Bn3662的互作蛋白,其中一个为蛋白磷酸酶BnPP2C。通过酵母双杂交回转验证,pull-down和Co-IP实验证明BnPP2C能够与Bn3662在油菜细胞中发生相互作用。推测BnPP2C与Bn3662相互作用,可能影响Bn3662的磷酸化水平,从而影响Bn3662在油菜中的生物学功能。