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病毒结构蛋白在组装病毒粒子,参与识别、黏附和侵入宿主细胞过程中有重要的作用。病毒对宿主细胞的吸附和侵入主要通过病毒粒子表面的黏附蛋白进行。石斑鱼虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus,SGIV)是一种从养殖石斑鱼中新发现的虹彩病毒,能够引起海水养殖鱼类的系统性感染及高死亡率,属虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus)。该病毒是大双链DNA病毒,基因组呈环状结构,长达140,131bp,共有162个开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码41-1268个氨基酸不等的蛋白质。
利用Farwesternblotting研究SGIV与宿主细胞GP细胞膜蛋白相互作用,获得2个候选病毒蛋白。通过基质辅助激光解吸时间飞行质谱(Matrix—assisted laser desorption/ionization time—of—flight tandem mass spectrometry,MALDI TOF/TOF MS)分析初步鉴定为SGIVVP39和VP75,分别由SGIVORF039L和ORF075R编码。对2个基因产物的氨基酸序列进行生物信息学分析发现,两者均不含有跨膜区和信号肽序列。VP39在虹彩病毒科内具有多个同源蛋白,对它们进行功能结构域比较发现,在N’端均包含2个C—adapt结构域,在C’端均含有蛋白激酶结构域,推测其功能可能与信号转导相关。而VP75含有1个保守的磷酸化位点,以及糖基化和十二烷基化等修饰位点。这些修饰位点可能与蛋白功能有重要关系。
通过设计引物对SGIVORF075R基因进行扩增,成功扩增出500bp片段。将扩增产物克隆到pET32a(+)载体,利用大肠杆菌BL21(DE3)株成功表达出重组VP75蛋白(rVP75)。用经肠激酶消化酶切后纯化的rVP75免疫BALB/cA小鼠得到多克隆抗体。
对ORF75R进行转录表达时相分析,表明该基因属于晚期(L)基因,转录和表达均从16h.p.i开始,持续到72h.p.i仍然有高水平的转录表达。抗体中和实验结果发现VP75抗体未能阻断病毒的感染。通过Farwesternblotting和Pulldownassay分析了rVP75与GP细胞蛋白的相互作用。出乎意外的是,未能检测到rVP75与GP细胞膜蛋白之间的相互作用。之前VP75的生物信息学分析结果表明该蛋白含有磷酸化、糖基化和十二烷基化修饰。糖蛋白染色实验发现,SGIVVP75染色信号很强,表明是一种糖蛋白。因此我们推测SGIVVP75可能在经过修饰之后才能与宿主细胞膜蛋白发生相互作用。进一步的证实其与细胞膜相互作用将为研究虹彩病毒的病理发生,尤其是病毒的吸附和侵入机制提供重要的信息。