骨缺损是临床常见的外科疾病。目前主要采用自体骨移植、异体骨移植技术、人工合成替代品来修复骨缺损，这些方法各有优缺点，难以满足临床上修复所有骨缺损的需要。随着骨组织工程研究的发展，将骨组织工程技术应用于临床已成为骨缺损修复的趋势所在。组织工程化骨成为最有希望进入临床应用的组织工程成果之一。在骨组织工程研究中种子细胞、支架材料、细胞与材料的相互作用是研究重点。骨组织工程要求其种子细胞应具备较强的增殖能力和良好的成骨功能。目前骨种子细胞的来源主要有骨、骨膜、骨髓、骨外组织和早期胚胎。由于骨髓间充质干细胞具有其他细胞无法比拟的优势，故已成为中外学者研究的热点。为了使其尽早应用于临床，我们针对目前的需要，设计了如下实验。 一、人骨髓间充质干细胞的体外培养和生物学特性的实验研究 目的 探索体外培养人骨髓间充质干细胞的最佳培养条件，研究其部分生物学特性，为相关研究和应用奠定基础。 方法 采用梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞，体外培养，传代增殖。相差显微镜观察形态变化，透射电镜观察超微结构。绘制生长曲线。流式细胞仪测定细胞周期和表型。观察生长因子bFGF对增殖的影响。 结果 以梯度离心法分离的MSCs细胞镜下呈成纤维细胞样梭形，具有快速增殖的能力；培养细胞在3-4d进入对数生长期，随后进入平台期；细胞传代后趋向均质、增殖迅速；超微结构显示为早期幼稚细胞形态；表面抗原表明为非造血系细胞；生长因子bFGF能有效促进细胞增殖。 结论 建立了人骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件，探讨了人骨髓间充质干细胞部分生物学特性，为进一步深入研究其诱导分化特性打下基础。骨髓间充质干细胞组织工程学生物特性及其单克隆抗体制备的实验研究中文摘要 二、诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化的实验研究 目的探讨人骨髓间充质干细胞向成骨和成软骨细胞诱导分化的能力。 方法选用不同代次的MSCs细胞，分别使用成骨和成软骨条件培养基培养，观察细胞的形态学变化，同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测碱性磷酸酶，钙盐沉积，糖胺多糖分泌和I、11胶原的表达。 结果MSCs细胞在地塞米松、维生素C和p一甘油磷酸钠的作用下，15d后可见细胞变为多边形，ALP和I型胶原染色阳性，形成钙结节，表现成骨细胞分化特点;而在维生素C和TGF一邵的作用下，7d可见细胞多为圆形，糖胺多糖和n型胶原染色阳性，表现成软骨细胞分化特点。但细胞分化特征的表达随细胞增殖有减弱趋势。 结论在一定培养条件下成功诱导人MSCs细胞向成骨和成软骨细胞分化，为我们进一步研究打下基础。 三、MSCs细胞诱导成骨细胞与可吸收性珊瑚轻基磷灰石的复合培养及bFGF的影响 目的观察人骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导的成骨细胞与珊瑚经基磷灰石的相容性，细胞在载体上的生长情况和bFGF的影响。 方法使用含地塞米松、p一甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基诱导MSCs细胞分化为成骨细胞，再与珊瑚经基磷灰石复合培养，分为实验组，bFGF组(1 on留mD和空白对照组。不同时间用倒置显微镜，扫描电镜观察，绘制细胞生长曲线，并进行细胞碱性磷酸酶的定量检测。 结果MSCs细胞诱导的成骨细胞体外培养与珊瑚经基磷灰石复合后顺利贴附，生长良好，增殖活跃，表现出典型成骨细胞的形态特征和生物学特性，并且细胞的功能未受不良影响，bFGF组细胞增殖明显。骨髓间充质干细胞组织工程学生物特性及其单克隆抗体制备的实验研究中文摘要 结论人MSCs细胞诱导的成骨细胞可以在一定的生物载体上正常生长、增殖、并保持生理功能，bFGF(10n留ml)可促进此过程中细胞增殖。同时也证明珊瑚经基磷灰石是一种较理想的骨组织工程支架材料。 四、人骨髓间充质干细胞表面抗原单克隆抗体制备的实验研究 目的制备人骨髓间充质干细胞的特异性细胞表面抗原的单克隆抗体。 方法以人骨髓间充质干细胞为抗原，常规方法免疫Balb/c小鼠，细胞融合制备杂交瘤细胞，并用免疫荧光法在流式细胞仪上对杂交瘤产生的抗体进行初测和复测。 结果通过分泌的抗体与人MCSs细胞表面抗原特异性结合的鉴定，进行杂交瘤筛选，将复测为阳性的克隆连续克隆化培养，获得2株持续分泌抗人MsCs细胞的杂交瘤细胞株:898、8f9。2株单抗经体外连续传代培养，生长良好，稳定分泌抗体。 结论人骨髓间充质干细胞的特异性细胞表面抗原单克隆抗体可望在MCss细胞的提纯和体外富集，特异性骨病的诊断等方面有广阔的应用前景。