第一部分中国汉族先天性无痛无汗症患者临床表型与基因型分析背景先天性无痛无汗症（Congenital insensitivity to pain with anhidrosis,CIPA）是一种极为罕见的常染色体隐性遗传病,发病机制是NTRK1基因突变导致其编码的酪氨酸激酶受体（Tropomyosin receptor kinase,Trk A）蛋白功能缺失,导致NGF依赖性初级传入神经元,包括初级感觉传入纤维（Aδ和C纤维）和自主交感神经节后神经元在发育过程中凋亡,使得背根神经节和皮肤中无髓鞘的神经纤维和薄髓鞘细的神经纤维完全缺失。其主要临床特征包括在任何条件下对伤害性刺激无躲避反应、无汗、反复高热和不同程度智力发育迟缓等。全球各地均有类似病例报道,其中十几年前日本和以色列学者总结了其种族特性,报道了特异性突变位点。目前关于中国CIPA的研究多以病例报道为主,对于中国CIPA患者的发病特征以及基因型和临床表型之间的复杂关系尚不清楚。本课题组前期收集并分析了13例中国汉族CIPA患者的NTRK1基因突变,对临床表型和遗传学特征尚无细致研究。目的收集临床病例并筛查致病基因突变位点,调查中国汉族CIPA患者的发病现状;分析临床表型和基因型特征及其之间的关联,并寻找汉族人群高发致病突变位点。方法1.通过医疗机构、媒体和社交网络收集CIPA病例,利用问卷调查表和现场检查相结合的方式采集患者及其家系的基本信息、临床表型（症状和体征、影像学等）和生物样本。2.采集患者及家系外周血,提取基因组DNA,通过直接Sanger测序、基因芯片和全基因组外显子测序三种方法筛查患者的致病基因突变位点。直接测序是检测NTRK1基因17个外显子和连接处50个内含子碱基序列,基因芯片是筛查NTRK1、NGF、PRDM12、TRPV1、SCN9A、DNMT1、WNK1等57个遗传学外周神经病变基因。全基因组外显子测序是针对上述两种方法均未筛查到突变位点后的选择。3.针对不同类型突变位点,进行生物信息学分析:错义突变利用Clustal Omega软件和SIFT软件分别用于分析突变的氨基酸保守性和预测其对Trk A蛋白功能的影响;内含子突变通过功能验证等方式分析突变对NTRK1剪接功能影响;插入、缺失突变通过分析阅读框移码后对NTRK1基因编码Trk A蛋白的影响。4.分析中国汉族CIPA患者的遗传学特点,寻找汉族人群高发突变位点。结果1.本研究共收集来自38个无关联家庭的44名中国汉族CIPA患者,患者家系分布主要集中在中国中南部地区,湖北、河南和山东患病人数最多;患者年龄主要处于青春前期,男女比例约为3:1,死亡率为9.3%。2.患者的临床特征存在显著差异,包括疼痛不敏感、温度觉和临床并发症等。奇怪的是,3例患者青春期后对伤害性刺激出现躲避反应,部分患者自述有“内脏痛”的感觉。定量感觉测试发现患者温度觉存在明显差异,多数患者四肢躯干冷觉、热觉和热痛觉缺失,但有数例患者能感知热刺激。3.患者骨骼、免疫、神经发育等方面都存在明显异常。患者反复骨折和关节脱臼的发生率分别为47.4%和13.2%。一对双胞胎患者的骨密度SOS值分别为3356 m/sec和3270m/sec,相对于正常同龄人百分位20和6。对CIPA幼儿期患者进行Gessel小儿发育评估,显示患儿在运动、应物、语言和社交能力四个方面均发育迟缓,尤其是应物和语言能力。4.本研究确定了39名患者共21个NTRK1突变位点,包括11个错义突变、1个无义突变、6个插入缺失突变和3个剪接突变。其中7个为新的未报道突变,分别为c.797G>A,c.1253₁254del TC,c.1729G>C,c.1775T>G,c.1805G>A,c.1806-2A>G和c.429–374_c.717+485del1403。5.通过全外显子测序发现一位患者外显子5和6峰值完全缺失,通过PCR步移法鉴定出具体突变序列,结果显示因剪接位点识别错误导致大片段缺失突变:c.429–374_c.717+485del1403（p.V144Nfs*8）,一共1403bp碱基序列丢失,导致氨基酸在144位由缬氨酸变为天冬酰胺,经过8个错误氨基酸终止,形成异常截短蛋白。6.超过52.3%的患者携带剪接突变c.851-33T>A,这强烈表明它可能是汉族患者的常见致病位点。结论本研究共收集44例中国汉族CIPA患者,基因检测筛查出21个致病突变,其中7个为未被报道新突变。患者的痛觉、温度觉、骨骼和神经系统等表型的详细描述有助于临床医生深入了解CIPA疾病,临床表型与基因型之间的关联需要进一步分析。针对汉族患者c.851-33T>A的高发特性,可以通过产前诊断的方法进行人群筛查,有利于优生优育。第二部分先天性无痛无汗症患者的外周感觉神经功能研究背景外周有髓鞘粗纤维Aβ传递信号经脊髓后角深层传出,产生触觉,有髓鞘细纤维Aδ和无髓鞘C纤维投射至脊髓后角浅层后向上传递,参与痛温觉等感觉的信息加工处理。而目前公认的CIPA致病机制为NTRK1基因突变导致NGF依赖性神经元包括细髓鞘A-δ纤维和C纤维以及交感节后神经元发育异常,出现疼痛、温度觉等感觉缺失。CIPA患者桡神经皮支的电镜研究显示小的有髓纤维和无髓纤维完全缺失,腓肠神经和正中神经的无髓鞘和小髓鞘纤维的数量减少。患者对表浅和深部组织疼痛刺激不敏感,包括内脏感觉,但是触觉、震动觉和位置觉正常。但是我们的临床研究发现部分患者存在疼痛“恢复”倾向,而且患者的温度觉感知也存在明显个体差异。对于这种表现我们无法明确患者是真的能感知疼痛信号还是后天习得对伤害性刺激表现出躲避行为,亦或者其他神经纤维如A-β异化迁移将高强度触觉信息传递为疼痛信号。此外,C纤维的一个亚群被认为介是导愉悦感官接触的。CIPA患者挠抓腋窝、脚心时会有“痒感”,但蚊虫叮咬等刺激无痒感和搔抓反应。他们是否能感知到感官上的（愉悦的）触摸还有待确定。目的本研究旨在通过定量感觉测试、电刺激单根神经纤维显微检测和轴突反射性红斑等方法探究CIPA传导感觉的外周A-β、A-δ纤维和C纤维的神经功能。方法1.纳入两名年龄分别为10岁和18岁的CIPA患者,可以语言沟通和描述自己感觉。通过定量感觉测试检测患者的毛刷（Brush）、机械感觉阈值（MDT）、机械疼痛阈值（MPT）、重复刺激后疼痛强度（WUR）、肌肉深压痛（PPT）、振动检测阈值（VDT）和温度觉（CDT、WDT和HPT）共9个测试参数,测试部位为脚背、对侧的手臂以及头面部三叉神经支配区,记录并分析测试结果。2.通过显微神经检测技术（MNG）采用不同规格电刺激检测患者单根神经纤维,以此评定患者外周神经末梢传递刺激信号的功能。首先将钨电极插入患者腓骨小头水平的腓神经包含皮肤C纤维的神经束中,测试者将两个细针电极插进该纤维支配的皮肤中,通过在神经支配区经皮施加电脉冲识别单根C-纤维。随后通过矩形脉冲、正弦脉冲和半正弦脉冲三种经皮电刺激检测感觉传导的三种神经纤维功能。3.将1%组胺和发痒黧豆滴入或插入受试者表皮,然后受试者每10秒告诉测试者他的感受,如痒、痛或是灼烧感。随后使用激光多普勒成像仪测量测试部位有无轴突反射红斑和分析轴突反射耀斑的大小。4.局麻下用皮肤活检环钻取患者手臂和足背两个部位各0.5mm2的皮肤组织样本,PBS冲洗后置于4℃2.5%戊二醛中固定并送检,电镜下观察CIPA患者皮肤组织样本中神经末梢结构。结果1.与正常健康人群测量阈值相比,患者的触觉（毛刷和MDT）基本正常,患者2测量的MDT阈值稍高;VDT、MPT、WUR、PPT和HDT均无疼痛感觉,表明患者三个部位的浅表痛、深压痛和热痛觉全部缺失。两位患者的手臂和脚背冷、热感觉缺失,无法辨别,仅脸部能感知热刺激。2.两位CIPA患者在矩形脉冲（A-δ）、正弦脉冲（CMi）、半弦脉冲（A-δ和CM）和1min正弦脉冲（CMi）刺激下作出NRS评分均为0。患者在高频矩形脉冲刺激下出现“麻”感觉,强度为10。正弦脉冲刺激下患者有感知,但是没有明显的痛苦。第一位患者在0.4m A刺激下有强度为7的“麻”感和轻微烧灼痛。1min正弦脉冲（CMi）刺激没有红斑反应是病理反应,说明不存在C纤维被激活。3.组胺和发痒黧豆刺激不能引发皮肤的局部轴突反射,没有痒感和红斑,表明患者的组胺敏感机械不敏感C纤维（CMi-H）和机械敏感型C纤维（CM）不能被激活。4.扫描电镜发现患者几乎完全没有带有无髓纤维和小髓纤维的初级传入神经纤维。手臂皮肤组织切片在一个视野下观察到有髓鞘神经纤维结构。结论本研究通过QST、MNG和扫描电镜等方法对CIPA患者的外周感觉神经信号传导功能进行检测,结果发现CIPA患者触觉正常,A-β纤维功能正常,而不同强度电刺激均不能引起患者疼痛感觉,表明传递伤害性刺激的CMi和CM纤维和A-δ纤维功能缺失,痒觉信息无法通过C纤维传递。虽然没有痛觉,但是有轻微异感（“麻”和烧灼感）,我们认为伤害性刺激可能通过残存的A-δ纤维传导,或者有可能类似与触摸痛机制,A-β神经纤维在高强度伤害性刺激下传递疼痛信号。后续课题组将继续深入CIPA患者的感觉神经功能研究,检测疼痛“恢复”患者的神经纤维功能,进一步探讨可能机制。