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目的通过研究单次和循环应用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)对荷瘤小鼠调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的影响及联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIKs)抗肿瘤的疗效,初步探讨环磷酰胺增强过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)肿瘤的机制,为提高ACI抗肿瘤疗效提供思路。方法体内动物实验以C57BL/6小鼠为研究对象,培养Hepa1-6小鼠肝癌细胞,注射于小鼠右侧腋下建立小鼠肝癌皮下模型。观察CTX对脾脏Tregs影响的实验中将造模成功的小鼠随机分为4组,每组40只小鼠,分别为正常小鼠组,单纯荷瘤小鼠组,单次应用CTX组,循环应用CTX组。每组分别用相应治疗方案干预后获取小鼠脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测CD4+CD25+FoxP3+/CD4+T细胞比例,隔天测量小鼠肿瘤长短径,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。体外培养CIKs实验将小鼠脾脏制成单细胞悬液,密度梯度离心法获得脾脏单个核细胞做为培养CIKs的前体细胞,在体外经干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、抗CD3e单克隆抗体(Anti CD3e monoclonal antibodies,anti-CD3Mab)、白介素-2(interlukin-2,IL-2)刺激,培养过程中绘制细胞增殖曲线,培养结束时用流式细胞术检测CIKs中的主要效应细胞表型CD8+NK1.1+的含量,CCK-8法检测CIKs对Hepa1-6肝癌细胞的杀伤活性。CTX联合CIKs治疗小鼠肝癌的实验中,将造模成功的荷瘤小鼠随机分为6组,每组5只,分别为单纯荷瘤组,单次CTX治疗组,循环CTX治疗组,单纯CIKs治疗组,单次CTX+CIKs治疗组,循环CTX+CIKs治疗组,每组分别用相应治疗方案干预后,隔天测量小鼠肿瘤长短径,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线,实验结束时,剥离瘤块称重,计算抑瘤率。结果在CTX对脾脏Tregs影响实验,未经CTX治疗组的荷瘤小鼠脾脏Tregs比例随时间延长逐渐增加;单次CTX治疗组Tregs比例出现短暂的降低,随后恢复到初始水平并持续升高;循环CTX组Tregs维持在较低水平。实验结束未经治疗的荷瘤小鼠、单次CTX、循环CTX治疗组小鼠肿瘤体积分别为4056.5±865.4 mm3、3517.9±756.5 mm3、2256.4±620.3 mm3,单次CTX组与单独荷瘤组肿瘤体积比较无差异(P>0.05),循环CTX组体积明显小于单独荷瘤组(P<0.01)。体外培养CIKs实验中,经2周的培养,细胞总量增加14.4倍;CD8+NK1.1+双阳性细胞的比例有由最初的0.7±0.3%增加到17.7±2.3%;在对Hepa1-6细胞的杀伤活性,效靶比为10:1、20:1、40:1时杀伤活性分别为25.99±3.53%、38.26±3.65%、54.77±5.35%。在CTX联合CIKs治疗小鼠肝癌实验,实验结束时单次CTX治疗组肿瘤体积与荷瘤对照组肿瘤体积无明显差异(3764.8±537.7 vs 3800.4±605.5 mm3,P=0.784);单独CIKs小于荷瘤对照组(3352.2±485.4 vs 3800.4±605.5 mm3,P=0.02);循环CTX明显小于单次CTX组(2076.6±620.2 vs 3764.8±537.7 mm3,P<0.001);单次CTX+CIKs组明显小于单次CTX组(1867.1±533.6 vs 3764.8±537.7 mm3,P<0.001),还小于单独CIKs组(1867.1±533.6 vs 3352.2±485.4 mm3,P<0.001);循环CTX+CIKs组明显小于循环CTX(970.7±135.3 vs 2076.6±620.2 mm3,P<0.001)、单独CIKs组(970.7±135.3 vs 3352.2±485.4 mm3,P<0.001),还小于单独CTX+CIKs组(970.7±135.3 vs 1867.1±533.6 mm3,P<0.001)。后期单独CTX或单独CIKs治疗组肿瘤体积迅速增加,而CTX和CIKs联合治疗组肿瘤体积保持平缓上升趋势。实验结束单次CTX治疗组,单独CIKs治疗组,循环CTX治疗组,单次CTX+CIKs治疗组,循环CTX+CIKs治疗组5组抑瘤率分别为3.7%、5.2%、48.1%、54.4%、78.6%。结论随着肿瘤发展,小鼠脾脏中Tregs比例逐渐增加;循环应用CTX能够使Tregs在较长时间内维持在相对较低水平,一定程度上抑制肿瘤生长,因此在临床应用中更有价值;用小鼠细胞因子IFN-γ、IL-2和小鼠Anti-CD3Mab刺激小鼠脾脏单个核细胞可成功培养出C57BL/6小鼠的CIKs,为相关动物实验的设计提供基础;低剂量CTX通过调控Tregs,能显著提高CIKs的疗效,以循环应用CTX效果最好,为CTX调控Tregs的基础上联合过继性免疫细胞治疗的临床应用提供理论依据。