缺氧是一种常见的病理过程,不仅见于高海拔地区,也见于缺血,出血,休克,早产及心血管疾病等。长期缺氧能引起细胞变性坏死,组织器官功能障碍甚至衰竭,而心、脑等器官的缺氧也是导致机体死亡的重要原因。因此了解缺氧生理病理及找到有效的补救措施对改善战斗医学,创伤损伤和心血管相关的伤亡至关重要。研究表明人体对缺氧具有一定的系统适应性,除支持全身氧气输送的心肺系统和血液系统的调节外,红细胞（Red blood cell,RBC）在机体缺氧适应进程中也扮演重要角色,其代谢、变形性和携氧释氧功能可参与、调控机体缺氧适应进程。同时,一氧化氮（Nitric Oxide,NO）是人体对缺氧产生生理反应的重要组成部分,它通过增加局部血流量和氧气输送来维持体内氧稳态。近年来,越来越多的证据证明NO在多种病理生理条件下,如镰状细胞性贫血,RBC储存病变和RBC老化等,通过S-亚硝基化（SNO）修饰对蛋白/巯基还原活性具有保护作用,参与调节包括糖酵解代谢、变形性和携氧释氧能力在内的RBC生理功能,因此我们猜想NO可能通过调节RBC变形性和携氧释氧功能参与RBC对缺氧的适应过程。然而,目前对于NO在缺氧氧化应激过程中与RBC功能的关系尚不明确,相关机制也不甚清楚。因此,本课题以RBC为研究对象,缺氧为研究条件,结合NO对RBC功能调节的积极作用,在缺氧环境/血液保存缺氧条件下探索RBC变形性和携氧释氧功能的适应与损伤情况及NO在其中的作用及机制,主要研究内容和结果如下:（1）不同缺氧时间下RBC缺氧适应与损伤情况及发生机制研究采用经典的缺血缺氧模型,即95%N₂和5%CO₂混合气体对RBC进行缺氧处理。在不同时间点（0、15、30、45、60、90、120min）对RBC变形性和携氧释氧功能进行分析,以探索RBC功能对缺氧的适应与损伤情况。结果显示在缺氧初期（0-45min）,RBC变形性无明显下降,携氧释氧功能热力学参数P50和动力学参数T50均显著减小,提示RBC维持良好变形能力的同时提高了O₂结合能力,而且RBC有效传输氧速率也有所增加,说明RBC在缺氧早期对缺氧具有一定的功能适应性;但缺氧45min之后,RBC变形性显著下降,P50和T50反而增加,提示缺氧时间延长后,RBC功能出现失代偿,结合O₂能力下降,释放O₂的速率减慢,RBC功能出现缺氧损伤现象。为了探究RBC功能缺氧适应与损伤的机制,我们对不同缺氧时间RBC氧化应激与抗氧化能力及膜蛋白组分进行分析,结果显示:缺氧初期,RBC抗氧化能力增强且无明显氧化损伤发生;缺氧45min后,RBC发生缺氧损伤:1)RBC膜脂过氧化显著增加、膜蛋白巯基及抗氧化物明显减少;2)游离血红蛋白（FHb）增多,出现溶血现象;3)高铁血红蛋白（metHb）水平及膜结合血色素水平没有明显时间依赖性;4)跨膜蛋白band 3出现明显聚簇化,并伴随酪氨酸磷酸化水平增加;5)酪氨酸磷酸化酶SHP-2活性巯基交联与band 3形成高聚物,失去PTP活性,同时酪氨酸磷酸化激酶Syk表达显著升高。结果提示缺氧可能通过氧化应激诱导RBC膜蛋白及GSH巯基氧化促进膜脂质过氧化,并诱导SHP-2的氧化失活及Syk表达上调,促进酪氨酸磷酸化,进而使膜蛋白band 3氧化交联、膜结构稳定性下降、降低Hb携氧释氧功能,参与RBC缺氧损伤进程。同时,为探究缺氧适应与损伤过程中NO水平变化,我们对缺氧期间NO水平进行测定,结果显示缺氧初期血清与RBC胞内NO水平升高,缺氧45min后血清中NO水平不再增加,RBC胞内NO水平下降。结合上述结果发现缺氧初期NO水平增加时RBC功能显示缺氧适应性,后期NO水平不再增加而RBC功能下降,提示缺氧初期诱导产生的NO可能与RBC功能的缺氧适应性有一定的联系,但还需要进一步验证。下一步对NO与缺氧RBC功能的关系进行深入的探讨。（2）NO对RBC缺氧适应的影响及机制探讨借助于（1）中构建的体外RBC缺氧平台,探究NO对RBC变形性和携氧释氧功能缺氧适应的影响及机制。结果显示,NO供体硝普钠（SNP）浓度对缺氧条件下RBC变形性具有双相调节作用,实验浓度范围内,SNP浓度为10^-6M的缺氧60min RBC具有最大的变形能力;补充最适浓度NO后RBC P50无显著变化,但T50显著减小,RBC释氧能力得到改善;RBC膜蛋白巯基及GSH水平显著性上调,缺氧诱导的膜脂质过氧化程度降低,提示补充NO对缺氧诱导的氧化应激具有一定的抑制作用;同时,补充NO可显著抑制Syk的表达及SHP-2的氧化交联,显著下调缺氧诱导的酪氨酸磷酸化水平,进而显著下调膜蛋白band 3氧化交联,对缺氧诱导的band 3结构与功能损伤具有明显的改善作用;提示缺氧诱导的RBC氧化损伤及功能下降与血液中NO水平密切相关。另一方面,利用一氧化氮合酶（NOS）抑制剂（L-NAME）抑制缺氧诱导产生的NO后,与缺氧组相比,RBC变形性和释氧能力下降,溶血现象更甚;膜脂质过氧化水平显著升高、膜蛋白巯基及GSH水平显著下降,酪氨酸磷酸化水平没有明显差异,但band 3交联程度显著增强,提示抑制缺氧诱导的NO产生会加速RBC缺氧损伤。对于缺氧诱导的metHb水平升高,补充或抑制NO无明显差异性。对补充/抑制NO后缺氧RBC膜蛋白酪氨酸硝基化情况进行检测,结果显示最适浓度SNP及L-NAME对缺氧诱导的酪氨酸硝基化情况无显著影响,提示补充适量NO并不会促进RBC发生硝化损伤。本部分研究结果提示NO对缺氧条件下RBC变形性和释氧能力的维持具有重要的作用,能有效的提高RBC缺氧适应性;通过本部分研究初步发现其作用机制:NO可能通过对膜蛋白巯基和GSH还原活性的调节抑制了缺氧诱导的膜脂质过氧化,并结合对SHP-2及Syk活性的调节使缺氧RBC酪氨酸磷酸化水平下降,维持跨膜蛋白band 3与膜骨架蛋白ankryin-spectrin的结合稳定性,抑制band 3的聚簇化及功能下降,维持缺氧RBC变形性及携氧释氧能力的稳定,参与RBC功能缺氧适应进程的调节。（3）NO对血液保存RBC缺氧适应与损伤的影响在（2）的研究基础上,进一步探究补充/抑制NO对血液保存这一相对缺氧环境中（0-35天）RBC变形功能缺氧适应与损伤的影响,并初步验证其作用机制。结果表明,保存0-7天,各组RBC变形性没有明显下降,14-35天后各组RBC变形性持续下降,较正常对照组显著降低,提示在血液保存过程中RBC变形性存在适应与损伤进程;与阳性对照组相比,补充NO能显著改善保存早中期（7-21天）RBC变形性,抑制NO使RBC变形性显著下降。补充NO对保存早中期RBC膜脂质过氧化有显著抑制作用、膜蛋白巯基氧化及GSH含量下降得到显著改善;抑制NO使保存RBC膜脂质过氧化显著增强、膜蛋白巯基及GSH显著减少。与（2）中的结果类似,补充NO可使保存0-14天RBC膜蛋白band 3交联及酪氨酸磷酸化程度显著降低,抑制NO使保存0-21天band 3交联及酪氨酸磷酸化程度显著增强;保存28-35天各组band 3交联及酪氨酸磷酸化水平无显著差异;保存期间补充或抑制NO对SHP-2向band 3的转移无显著影响;补充NO显著抑制了保存RBC Syk的表达,抑制NO的产生显著上调了Syk的表达。结果提示,抑制保存期间NO的产生可促进RBC氧化应激损伤、促进Syk和Lyn的表达增加酪氨酸磷酸化水平,同时增加band 3氧化交联,进而降低RBC变形性;本部分研究结果,进一步在血液保存缺氧条件下探究NO对RBC变形能力的影响,验证了NO在缺氧RBC功能适应中的积极作用及其作用机制,为后续研究机体缺氧适应与损伤提供参考。综上所述,本文研究了RBC变形性和携氧释氧功能的缺氧适应性及NO在其中的作用并对其调控机制进行了探索;本文的研究结果有助于深入认识NO通过RBC功能的调节,影响机体缺氧适应与损伤进程的重要地位;同时从分子生物学的角度为临床缺氧相关疾病的预防和治疗提供新的研究视角和思路。