论文部分内容阅读
现代高产奶牛乳腺疾病严重制约了奶牛养殖业的可持续发展,影响了奶牛养殖行业的经济效益。促进干奶期奶牛乳腺退化能够降低干奶期乳腺内感染发病率,促进乳腺的修复与更新,降低下一泌乳周期乳腺炎发病率。前人研究发现5-羟色胺（5-HT）能够促进奶牛干奶期乳腺退化,因此,本研究首先以山羊为模型,采用过瘤胃包被技术,明确5-HT的前体物质5-羟基色氨酸（5-HTP）对反刍动物血清5-HT浓度的影响及其对乳腺退化的促进作用;随后以奶牛乳腺上皮细胞MAC-T为研究对象,进一步探究5-HT作用机制,研究结果可为反刍动物体内5-HT水平调控提供新的方法和思路。试验一:选择体况接近的3～4岁成年健康山羊16头（体重30±5.2kg）,随机分为4组,每组4个重复。每天上午9点在精料中添加过瘤胃包被5-HTP,混匀饲喂,饲喂量分别为0、4、20和100 mg/kg BW,饲喂两天。山羊自由采食与饮水。分别在开始饲喂5-HTP后第0、3、6、12、24 h采集血液,检测血清生化指标5-HTP、5-HT、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）的浓度,第二天监控观察山羊行为特征。结果一:饲喂过瘤胃包被5-HTP的血清处理组相对于对照组:5-HTP在6 h达到最高水平,5-HT在12h达到最高水平,5-HIAA在24h达到最高水平;饲喂低剂量的包被5-HTP（4、20 mg/kg BW）对山羊产生显著的镇定作用（P＜0.05）;100 mg/kg BW处理组血清碱性磷酸酶活性显著升高（P＜0.05）,丙氨酸氨基转移酶活性显著下降（P＜0.05）。结果表明,过瘤胃包被5-HTP可有效提高山羊体内5-HT水平,但过高浓度的5-HTP饲喂水平可能会造成动物肝脏损伤。试验二:选择体况接近的健康泌乳末期山羊16头（体重35±5kg）,6～8胎次,同时进入干奶期。随机分为2组,每组8个重复,每头山羊单独饲喂,饲喂相同水平精料（0.8 kg/d）,粗料自由采食。从干奶第2天开始,上午9点在精料中分别添加0 mg/kg BW、20 mg/kg BW过瘤胃包被5-HTP,混匀饲喂,连续饲喂5 d,晚上饲喂正常无添加5-HTP的饲料,自由饮水。每天下午4点采集奶样。于第5天早上空腹采集血液。记录山羊粗饲料采食量,检测乳汁中体细胞数（SCC）、乳铁蛋白水平、钠钾离子比值、血清白蛋白浓度和乳酸脱氢酶活性。结果二:过瘤胃包被5-HTP显著提高乳汁中的SCC、乳铁蛋白水平、钠钾离子比值、血清白蛋白浓度和乳酸脱氢酶活性（P＜0.05）;从饲喂第三天开始5-HTP饲喂组山羊粗料采食量开始下降（P＜0.05）。本实验结果表明饲喂20 mg/kg BW的过瘤胃包被5-HTP可促进山羊干奶期乳腺退化。试验三:体外培养奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,以不同浓度的5-HT（0、0.2、2、20、200μg/m L）处理,检测处理24 h后细胞内5-HT浓度;处理24 h、72 h后细胞增殖活性;细胞间紧密连接的跨膜电阻值;随后采用0、2、200μg/m L 5-HT处理细胞24h后进行转录组分析,并采用RT-PCR验证相关基因表达。结果三:2、20μg/m L 5-HT显著提高MAC-T细胞内5-HT浓度（P＜0.05）;0.2、2、20μg/m L 5-HT处理MAC-T细胞24h促进细胞增殖（P＜0.05）,200μg/m L处理抑制细胞增殖,降低细胞活性（P＜0.05）;5-HT处理组细胞跨膜电阻显著下降（P＜0.05）;通过对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,促进乳腺退化机制可能与坏死性凋亡通路、NOD样受体通路和PI3K-Akt通路有关,其中H2AC19、STAT家族、PYGM、SQSTM1、干扰素α2,干扰素β2、IFI16可能在血清素诱导乳腺退化中发挥重要作用。RT-PCR结果表明,0.2、2μg/m L 5-HT促进TG-2表达（P＜0.05）,200μg/m L 5-HT抑制TG-2基因表达（P＜0.05）。200μg/m L 5-HT处理显著提高TGF-β1和Caspase-3基因表达（P＜0.05）,并显著降低细胞紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-4、Claudin-8表达（P＜0.05）。试验四:体外培养奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,使用TG-2酶抑制剂MDC,分组处理细胞:对照组（0μg/m L）、2组（2μg/m L 5-HT）、200组（200μg/m L 5-HT）、MDC组（200μM MDC）、2+MDC组（2μg/m L 5-HT+200μM MDC）、200+MDC组（200μg/m L 5-HT+200μM MDC）24h,检测细胞增殖活性、紧密连接跨膜电阻、相关基因的表达结果四:TG-2酶抑制剂MDC处理24h,对细胞活性无显著影响（P＞0.05）,处理72小时显著抑制细胞增殖（P＜0.05）;5-HT和MDC共同处理细胞,显著抑制MAC-T细胞活性（P＜0.05）;MDC处理组电阻在第一天上升,随后显著下降（P＜0.05）;其余各处理组电阻值均显著下降（P＜0.05）。RT-PCR结果中,2+MDC组紧密连接相关基因表达量下降（P＜0.05）;200+MDC组Claudin-1上升（P＜0.05）;200+MDC组TGF-β1表达量显著低于对照组（P＜0.05）,MDC、2、200、2+MDC处理组表达量显著高于对照组（P＜0.05）。综上所述:饲喂反刍动物过瘤胃包被5-HTP提高其体内5-HT水平具有可行性,20 mg/kg BW的过瘤胃5-HTP可显著促进反刍动物干奶初期的乳腺退化。200μg/m L的5-HT能够抑制奶牛乳腺上皮细胞活性,增大细胞间紧密连接通透性。转录组结果表明5-HT能够影响细胞凋亡相关通路、PI3K-Akt-TGF-β1和细胞周期信号通路的相关基因表达,以上信号通路可能在5-HT促进细胞凋亡和乳腺退化过程中发挥作用。血清素化可能参与了200μg/m L 5-HT引起的细胞凋亡过程以及紧密蛋白Claudin-1的调控过程。