论文部分内容阅读
FLAG标签是由八个氨基酸残基DYKDDDDK组成的表位标记物(epitope),序列简短,对目标蛋白的结构和生物活性影响小,可以用一条人工合成的寡聚核苷酸来编码。FLAG标签可以融合到目标蛋白的N端或者C端,或与其他亲和标签串联使用。FLAG自身含有一个肠激酶切割位点DDDDK,可以通过肠激酶切割除去。现已发展出三种抗FLAG单克隆抗体M1、M2和M5,单抗M1特异性识别具有N-FLAG序列的融合蛋白,单抗M5的出现是为了应用于具有N-Met-FLAG序列的融合蛋白,显示出对N端Met-FLAG具有更高的亲和力,单抗M2可以识别以上几种N端或C端FLAG融合蛋白,因而具有通用性。FLAG标签已广泛应用于重组蛋白的免疫印迹、免疫吸附纯化、免疫共沉淀等领域。
为了在多肽芯片上应用FLAG标签检测蛋白质的相互作用,以FLAG的原始序列DYKDDDDK为模板,设计了两个新的序列DYKDYKYK和DYKGGGYK,通过两次PCR反应分别将以上三种FLAG标签融合到人SHP-2基因编码的NSH2蛋白的C端,将His标签融合到NSH2蛋白的N端并将其命名为His-NSH2-FLAG基因,该系列重组基因长348bp,编码116个氨基酸,预测分子量为1.kDa。将PCR扩增得到的His-NSH2-FLAG基因亚克隆到表达载体pGEX-2t相应的酶切位点上,得到重组表达质粒pGEX-2t-His-NSH2-FLAG,PCR扩增、双酶切及DNA测序鉴定表明重组质粒构建正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并在LB培养基中表达重组蛋白,用终浓度为0 mM的IPTG在30℃诱导重组菌3h后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在4.kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值相符(GST融合标签2.kDa,His-NSH2-FLAG1.kDa),该系列重组蛋白以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中。经GST亲和纯化和FPLC分子筛层析进一步纯化后,SDS-PAGE电泳分析表明纯化所得重组蛋白纯度高于90%。Wester.blotting分析表明单克隆抗体M2能够特异性识别以上三种FLAG标签。非竞争性酶免疫法测得单克隆抗体M2与三种FLAG标签DYKDDDDK、DYKDYKYK、DYKGGGYK相互作用的亲和常数分别为0.077μM、0.102μM、0.126μM。亲和常数的获得,为更好的应用FLAG标签打下了基础。