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O-连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是糖蛋白常见的翻译后修饰,它存在于所有多细胞生物体中,O-GlcNAc的调控出错与众多的疾病相关联,如癌症、二型糖尿病和老年性痴呆。对杆状病毒基因组全序列的分析发现杆状病毒具有30个共有的保守基因,它们组成了杆状病毒的核心基因,gp41糖蛋白基因便是30个核心基因之一。本论文选择斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)gp41基因及其编码的GP41糖蛋白作为研究对象,对其转录特征、翻译后的加工修饰、亚细胞定位与病毒结构定位、修饰的糖苷类型等进行了系统的研究;并综合利用Bac-to-Bac和ET重组的策略,构建了缺失苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AutographacaiifornicamultinucleocapsidmultinucleocapsidNPV,AcMNPV)gp41基因的重组病毒,研究GP41蛋白对病毒侵染的影响。
序列分析表明,SpltMNPVgp41基因位于基因组ORF76,编码330个氨基酸,预计分子量为36.894kDa,在gp41基因起始密码子ATG的上游存在一个保守的杆状病毒晚期基因启动子元件——ATAAG,在终止密码子TGA的下游没有发现典型的polyA加尾信号。氨基酸序列分析发现GP41含有一个潜在的O-连接糖基化位点和四个潜在的N-连接的糖基化位点。氨基酸亲水性分析表明,GP41蛋白可能是膜蛋白,但GP41不是整合膜蛋白。
氨基酸同源性比较分析发现,SpltMNPVGP41与中国棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)和美国棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpazeasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HzSNPV)的同源性最高,为66%;与颗粒体病毒(Granulovirus,GV)同源性相对较低,为32~36%;与CuniNPV(Culexnigripalpusnucleocapsidnucleopolyhedrovirus)同源性最低,只有6%。氨基酸序列排比及蛋白质二级结构预测显示,SpltMNPVGP41存在与其他杆状病毒所共有的结构特征,10个α-螺旋和2个β-折叠以及其他的保守区。在所有已知NPVs的GP41中(CuniNPV除外),其N-端约有50-60个氨基酸残基组成一个保守的蓝色铜蛋白Cupredoxin结构域。
在离体条件下,RT-PCR分析表明,SpltMNPVgp41基因的转录从病毒感染后12h就能检测到,并且持续到感染后96h;5RACE结果表明,SpltMNPVgp41基因转录起始位点在ATG上游晚期启动子ATAAG中的碱基T。Western印迹结果表明,SpltMNPVgp41基因编码的蛋白在宿主细胞中晚期表达。综合这些结果,可以确定SpltMNPVgp41基因是晚期表达基因。
通过PCR方法扩增得到SpltMNPVgp41全长基因,将其克隆到5端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上并转化大肠杆菌M15[PREP4],在IPTG诱导下表达了一个分子量为37.9kDa融合蛋白。以纯化过的6×His-GP41融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,得到该蛋白的抗血清。免疫印迹分析表明,该抗血清能与感染斜纹夜蛾核多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。在SpltMNPV感染的细胞中GP41蛋白的大小为41kDa,较融合蛋白大3kDa,推测该蛋白发生了翻译后修饰。衣霉素抑制试验和N-糖苷酶PNGaseF试验证实了GP41蛋白没有被N-糖基化。然而采用生物素标记的凝集素印迹试验,有3种识别O-GlcNAc糖苷的凝集素(ECL、LEL和BSL)与SpltMNPVGP41蛋白结合,证实了SpltMNPVGP41是O-连接的GlcNAc糖蛋白。
Western印迹和间接免疫荧光实验结果显示:在病毒感染的早期,SpltMNPVGP41蛋白分布在感染细胞的细胞核中;晚期则分布在整个细胞中。病毒结构中的定位分析显示,SpltMNPVGP41是包埋型病毒粒子(occlusion-derivedvirus,ODV)特有的结构蛋白;存在于ODV的囊膜(E)中。
本论文还综合利用Bac-to-Bac和ET重组的策略,通过基因敲除等方法研究了AcMNPVGP41蛋白在杆状病毒感染周期中的生物学功能。
首先,人工合成一对长76bp的引物,其中50bp与AcMNPVgp41基因跨膜结构域(TD)侧翼序列同源,另26bp分别为带自身启动子的氯霉素抗性基因(Cm)的两端序列,通过PCR方法扩增获得同源重组线性DNA片段,用限制性内切酶DpnI消化模板以分离纯化线性DNA片段。将此线性DNA同源片段电激转化入含AcMNPVBacmid的大肠杆菌E.coli中,诱导同源重组,筛选gp41基因缺失而插入Cm基因的重组BacmidAcgp41KO。为了更直接的观察gp41基因可能对病毒侵染产生的影响,将可在荧光显微镜下观察的gfp基因和可在相差显微镜下观察的多角体基因作为双标记基因,通过Bac-to-Bac系统的转座作用插入Acgp41KO,构建缺失型重组病毒AcKO-GP。置于早期启动子ie-1下表达的GFP荧光蛋白用以指示重组病毒芽殖型病毒粒子(buddedvirus,BV)在离体细胞中的传播,多角体蛋白则用来指示重组病毒在离体细胞中感染的进程。为了确证AcKO-GP在其增值感染中表型的改变确实是由gp41基因的缺失所导致,将受其自身启动子控制下的gp41基因同样通过转座作用补回Acgp41KO,获得补回型重组病毒AcGP-R。野生型AcMNPVBacmid通过转座作用获得双标记的重组病毒AcWT-GP。将三种重组病毒DNA分别转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)昆虫细胞(Sf-9),由GFP的传播状态可直接观察这三种重组病毒的侵染能力的区别。Westernblot分析显示,AcMNPVgp41基因TD区的缺失,使AcMNPVgp41基因无法表达AcMNPVGP41蛋白,AcMNPVgp41基因TD区的缺失能够用以研究AcMNPVgp41基因对病毒侵染的影响;补回型重组病毒AcGP-R使补回的AcMNPVgp41基因表达出AcMNPVGP41蛋白,补回型重组病毒AcGP-R可以作为研究AcMNPVgp41基因对病毒侵染影响的佐证。显微镜观察结果显示,AcGP-R和AcWT-GP均能产生BV和ODV,且两种的BV生长曲线也基本一致;与此相反,AcKO-GP在转染的晚期能够产生ODV,然而不能产生BV粒子,而使病毒无法扩散,而且ODV的数量仅保持在初级转染水平。重组病毒转染上清的感染试验进一步证实,gp41基因的缺失导致病毒无法产生BV。
综合上述研究结果说明,gp41基因是病毒侵染过程中BV的产生所必需的。