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目前,乙型和丙型病毒性肝炎已在全世界范围内引发了主要的公共健康问题。乙型和丙型病毒性肝炎的致病源分别为乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。对于它们的标志物检测包括许多种,主要分为基因扩增实验和免疫学标志物的检测。前者以PCR方法为基础,然而这类方法操作过程较为繁琐,且需要依赖贵重的仪器,这样对实验者的技能要求高,实验成本也较高。免疫学检测方法通常较为简便和经济。目前在临床诊断中,酶联免疫吸附方法和快速诊断试纸方法的应用较为广泛。但是这两种方法也存在着许多弊端,主要表现在它们均不能同步平行地检测多个项目指标。在我们的实验研究中,我们建立了一种蛋白质芯片实验技术平台。在这个平台之上,以蛋白质芯片技术为基础,采用纳米金银免疫染色放大方法输出信号,达到快速、目视化观察结果的目的。并以乙型和丙型肝炎抗体的同步检测为例,对这项技术进行验证。
在实验中,我们分别采用戊二醛和3-甘油丙基三甲氧基硅烷2种不同方法对超平光学载玻片表面进行化学修饰,并比较2种芯片固定蛋白的效率。HBsAg,HBeAg,HBcAg和HCVAg(NS3,NS5和coreantigens的混合物)被固定在片基上以制备同步检测乙型和丙性肝炎抗体的蛋白质芯片,以胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为检测探针,最后的结果用银染方法进行信号放大,产生可目视化观察到的黑色点阵。实验中构建了一组模式芯片来初步评估免疫金银染色法蛋白质芯片的检测下限,将固定于芯片片基上人IgG蛋白分别与3μg/ml、300ng/ml、30ng/ml、3ng/ml的anti-IgG蛋白进行孵育反应,分析实验结果。
实验结果显示,制备的胶体金在电镜下观察为单一分散的圆球型颗粒,平均粒径15±2nm。胶体金标记SPA后仍然均匀分布,且保持稳定。优化后的最佳银染时间为8-12分钟。蛋白质芯片实验初步评估的检测下限达到3ng/ml,接近荧光检测方法(1ng/ml)。在临床验证实验中,配对卡方检验的结果为P>0.05,表明蛋白质芯片实验与ELISA方法的检测结果无明显差异,且所有的血清标本在检测过程中未观察到交叉反应的出现。这表明基于纳米金银免疫染色放大方法的蛋白质芯片技术可以用于乙型和丙型肝炎病毒抗体的快速同步目视化检测。