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目的免疫避孕与免疫不孕是生殖研究领域的两大重要课题,寻找合适的精子膜抗原是解决这两个问题的关键所在。精子膜抗原与受精和胚胎的早期发育有密切关系,其中部分抗原能引起机体产生相应的抗体,导致免疫性不孕。人精子顶体膜相关蛋白32(Human Sperm Acrosomal Membrane-Associated Protein32,hSAMP32)hSAMP32cDNA(complement DNA)长度1455bp,基因定位于6q15-16.2,编码294个氨基酸,分子量32KDa,等电点4.57。hSAMP32的组织定位具有睾丸特异性,分布于精子顶体赤道区及顶体内膜。hSAMP32在精卵结合以及精卵融合过程中发挥重要作用,是导致免疫不孕众多因素之一。基因疫苗是二十世纪九十年代发展起来的一种新型疫苗,它是指将编码特定抗原的基因克隆到合适的质粒载体上,制备成核酸表达载体,通过肌肉注射、腹腔注射等方法将其导入宿主机体,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质,从而激发机体产生特异性的免疫应答,所以又被称为核酸疫苗或基因疫苗。基因疫苗具有免疫持续时间长、制备、携带方便、价廉等优点,它在免疫避孕方面的应用促进了避孕疫苗的发展。本实验选择hSAMP32为靶基因,应用RT-PCR技术克隆出人hSAMP32cDNA,再以真核表达质粒pcDNA3.1(+)为载体构建hSAMP32避孕疫苗,为进一步研究开发避孕疫苗奠定基础。方法1.逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增hSAMP32基因片段:根据GenBank(AF203447)报道的hSAMP32基因序列设计一对引物,在引物的5’端加上BamHI和XhoI酶切位点,以便插入pcDNA3.1(+)真核表达载体。提取人睾丸组织总RNA,逆转录cDNA,PCR扩增目的基因片段。2.hSAMP32基因测序:琼脂糖电泳,回收目的条带,同T载体连接。转化大肠杆菌TG1菌株,氨苄青霉素(Amp)和蓝白斑筛选。挑选白色菌落,进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定,送TaKaRa公司测序。3.重组质粒pcDNA3.1(+)-hSAMP32的构建:将克隆至PGEM-T载体的hSAMP32基因片段用BamHI和XhoI双酶切后,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,PCR及双酶切鉴定。4.动物实验:用基因枪技术把重组质粒pcDNA3.1(+)—hSAMP32导入BALB/c小鼠股四头肌部位,观察BALB/c小鼠生殖能力是否受到影响。5.体外表达:将hSAMP32基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T3构建成重组质粒PGEX-4T3—hSAMP32,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果1.RT-PCR扩增片段电泳结果:PCR扩增出一条882bp条带,测序结果与GenBank(AF203447)报道的基因序列一致。2.pcDNA3.1(+)—hSAMP32重组质粒鉴定:双酶切产物经1%琼脂糖电泳后,在Marker882bp对应处出现目的条带。3.动物实验:hSAMP32目的基因组BALB/c小鼠2次基因枪轰击后妊娠率与对照组相比明显下降,同时用鼠抗hSAMP32血清做穿卵实验明显降低精子穿卵率。4.体外表达:重组质粒PGEX-4T3-hSAMP32转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示:PGEX-4T3—hSAMP32表达分子量为59KDa的蛋白条带与预期蛋白分子量理论值一致。结论1.成功构建了pcDNA3.1(+)-hSAMP32重组质粒。2.基因枪介导基因转染法能够高效将pcDNA3.1(+)—hSAMP32基因疫苗转染到小鼠骨骼肌中。3.重组质粒pcDNA3.1(+)—hSAMP32作为避孕疫苗能明显降低小鼠受孕率。