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目的免疫避孕与免疫不孕是生殖研究领域的两大重要课题，寻找合适的精子膜抗原是解决这两个问题的关键所在。精子膜抗原与受精和胚胎的早期发育有密切关系，其中部分抗原能引起机体产生相应的抗体，导致免疫性不孕。人精子顶体膜相关蛋白32(Human Sperm Acrosomal Membrane-Associated Protein32，hSAMP32)hSAMP32cDNA(complement DNA)长度1455bp，基因定位于6q15-16.2，编码294个氨基酸，分子量32KDa，等电点4.57。hSAMP32的组织定位具有睾丸特异性，分布于精子顶体赤道区及顶体内膜。hSAMP32在精卵结合以及精卵融合过程中发挥重要作用，是导致免疫不孕众多因素之一。基因疫苗是二十世纪九十年代发展起来的一种新型疫苗，它是指将编码特定抗原的基因克隆到合适的质粒载体上，制备成核酸表达载体，通过肌肉注射、腹腔注射等方法将其导入宿主机体，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，从而激发机体产生特异性的免疫应答，所以又被称为核酸疫苗或基因疫苗。基因疫苗具有免疫持续时间长、制备、携带方便、价廉等优点，它在免疫避孕方面的应用促进了避孕疫苗的发展。本实验选择hSAMP32为靶基因，应用RT-PCR技术克隆出人hSAMP32cDNA，再以真核表达质粒pcDNA3.1(+)为载体构建hSAMP32避孕疫苗，为进一步研究开发避孕疫苗奠定基础。方法1．逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)扩增hSAMP32基因片段：根据GenBank(AF203447)报道的hSAMP32基因序列设计一对引物，在引物的5’端加上BamHI和XhoI酶切位点，以便插入pcDNA3.1(+)真核表达载体。提取人睾丸组织总RNA，逆转录cDNA，PCR扩增目的基因片段。2．hSAMP32基因测序：琼脂糖电泳，回收目的条带，同T载体连接。转化大肠杆菌TG1菌株，氨苄青霉素(Amp)和蓝白斑筛选。挑选白色菌落，进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，送TaKaRa公司测序。3．重组质粒pcDNA3.1(+)-hSAMP32的构建：将克隆至PGEM-T载体的hSAMP32基因片段用BamHI和XhoI双酶切后，连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，PCR及双酶切鉴定。4．动物实验：用基因枪技术把重组质粒pcDNA3.1(+)—hSAMP32导入BALB／c小鼠股四头肌部位，观察BALB／c小鼠生殖能力是否受到影响。5．体外表达：将hSAMP32基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T3构建成重组质粒PGEX-4T3—hSAMP32，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白表达。结果1．RT-PCR扩增片段电泳结果：PCR扩增出一条882bp条带，测序结果与GenBank(AF203447)报道的基因序列一致。2．pcDNA3.1(+)—hSAMP32重组质粒鉴定：双酶切产物经1％琼脂糖电泳后，在Marker882bp对应处出现目的条带。3．动物实验：hSAMP32目的基因组BALB／c小鼠2次基因枪轰击后妊娠率与对照组相比明显下降，同时用鼠抗hSAMP32血清做穿卵实验明显降低精子穿卵率。4．体外表达：重组质粒PGEX-4T3-hSAMP32转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析显示：PGEX-4T3—hSAMP32表达分子量为59KDa的蛋白条带与预期蛋白分子量理论值一致。结论1．成功构建了pcDNA3.1(+)-hSAMP32重组质粒。2．基因枪介导基因转染法能够高效将pcDNA3.1(+)—hSAMP32基因疫苗转染到小鼠骨骼肌中。3．重组质粒pcDNA3.1(+)—hSAMP32作为避孕疫苗能明显降低小鼠受孕率。