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多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是女性常见的内分泌代谢异常性疾病,是育龄期妇女出现不孕的主要病因,远期发展成子宫内膜癌、2型糖尿病、心血管疾病及非酒精性脂肪肝的风险较大,贯穿女性一生,影响了5%-10%育龄妇女,且目前缺乏根治的手段和预防措施,因此是生殖领域研究的热点和难点。随着高通量测序、芯片技术的发展,环状RNA（circular RNA,circ RNA）因为表达稳定、作用广泛已经成为肿瘤、神经疾病等领域的研究热点,在生殖生育研究中仍有较大空间。颗粒细胞为卵母细胞提供生长所需的能量、激素,是女性生殖领域良好的非侵入性研究手段。近一年,有少量报道确认在生育年龄妇女颗粒细胞中存在circ RNA表达,并且和PCOS女性之间存在差异。PCOS诊断标准之一即卵巢多囊样改变。窦卵泡数量的增加伴随着颗粒细胞增殖/凋亡异常。circ RNA在PCOS患者颗粒细胞的功能未见报道,也不清楚颗粒细胞异常增殖/凋亡的调控机制。因此,开展以下三部分研究。第一部分研究circ RNA、m RNA在PCOS和非PCOS患者颗粒细胞中的差异表达,对母基因进行生信富集分析,和临床指标进行矩阵分析;第二部分在原代颗粒细胞中研究PCOS患者颗粒细胞目标环状RNA的表达。在颗粒细胞系KGN中研究目标环状RNA的亚细胞定位、稳定性及颗粒细胞增殖/凋亡中的功能。第三部分在颗粒细胞系KGN中研究目标环状RNA在颗粒细胞增殖/凋亡中的分子机制。本研究通过这三方面以期为深入了解PCOS患者circ RNA的差异表达,为明确目标环状RNA在PCOS致病机制提供新的理论基础。第一部分PCOS患者卵泡颗粒细胞环状RNA及m RNA表达谱研究目的:检测PCOS患者取卵日黄素化颗粒细胞中circ RNA、m RNA的表达,和健康女性进行对照,建立差异表达谱。研究方法:收集3例的PCOS患者及3例非PCOS患者取卵日颗粒细胞,芯片检测circ RNA和m RNA,制备表达谱。差异基因进行GO分析、KEGG分析。生信分析预测下游可能结合的mi RNA及m RNA,构建ce RNA网络。使用q RT-PCR在另外10对原代颗粒细胞中检测13条差异明显的circ RNAs的表达,进一步和生化指标进行相关性分析。结果:1.PCOS患者卵泡颗粒细胞环状RNA表达谱PCOS女性颗粒细胞中检测出86205个circ RNAs。circ RNAs在不同染色体上均有分布。与非PCOS女性相比,以P值<0.05,上下2倍差异作为筛选标准,共得到595个差异circ RNAs。13个circ RNAs和3个母源m RNA（EML5,FASD1,FASD2）的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。雄激素水平、AMH水平等PCOS临床指标均和hsacirc0032873,hsacirc0032868,hsacirc0032872,hsacirc0032883,hsacirc0032875,hsacirc0032871正相关（P<0.05）。2.PCOS患者和非PCOS患者卵泡颗粒细胞环状RNA富集分析KEGG分析发现circ RNAs母基因及m RNA集中在卵子成熟、激素合成、盐/脂吸收等通路,可能参与PCOS的发生发展。结论:PCOS患者颗粒细胞内存在大量circ RNAs,和非PCOS女性相比有较多个差异基因,且富集在多条与PCOS发病相关的通路上。第二部分:环状RNA circ EML5-1对颗粒细胞增殖与凋亡的影响目的:探讨目标环状RNA对颗粒细胞增殖、凋亡的影响。方法:1.鉴定候选circ RNA以KGN细胞为模板制备c DNA、g DNA,使用divergent及convergent引物分析circ RNA与母基因的表达;RNA-FISH检测circ RNA亚细胞定位;PCR产物送sanger测序;用q RT-PCR检测Rnase R处理前后circ RNA与母基因的表达;使用q RT-PCR在另外20对原代颗粒细胞中检测circ RNAs的表达。2.检测circ EML5-1在颗粒细胞系中发挥的生物学功能向颗粒细胞系（KGN）中转染候选circ RNA的si RNA,通过CCK8、流式细胞实验、western blot等方法检测其对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。进一步向KGN细胞中转染候选circ RNA的过表达质粒,通过CCK8、流式细胞仪、western blot等方法检测其对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.候选circ RNA的环状结构及稳定性分析在线circinteractome工具发现hascirc0032875是EML5第2-10外显子反向剪切形成的环状结构,并经sanger测序证实剪切位点,命名为circ EML5-1。convergent引物在KGN的c DNA、g DNA模板中均可扩增circ EML5-1相关片段。divergent引物仅能在c DNA中扩增。RNase R实验发现,与相应的线性RNA EML5相比,在酶处理前后circ EML5-1的含量无明显差异。非PCOS患者相比,circ EML5-1在PCOS患者原代颗粒细胞中表达明显上调。2.circ EML5-1的生物学功能利用si RNA在KGN中敲低circ EML5-1的表达,CCK8实验提示颗粒细胞增殖受到显著抑制,凋亡相关蛋白Bax,cleaved-caspase3表达量增加,流式细胞实验显示凋亡细胞数量增加。circ EML5-1过表达后颗粒细胞增殖及凋亡得到相反的结果。结论:circ EML5-1存在颗粒细胞胞浆中,独立成环,比母基因稳定,具有影响颗粒细胞增殖和凋亡的功能。第三部分:circ EML5-1参与调控PCOS发生的分子机制目的:探索circ EML5-1在PCOS发生中的分子机制。方法:生物信息学网络分析预测circ EML5-1的下游mi RNA及下游m RNA。采用q RT-PCR技术检测circ EML5-1 OE、si RNA质粒转染前后mi RNA含量的变化。使用q RT-PCR在另外20对原代颗粒细胞中检测mi RNA的表达。采用CCK8、western blot技术检测mi RNA在KGN细胞增殖、凋亡中的功能。利用RIP、Pull down、双荧光报告系统等细胞功能学实验方法探索circ EML5-1与下游mi RNA相互作用。利用双荧光报告系统实验方法探索下游mi RNA对下游m RNA的相互作用。最后采用回复实验验证circ EML5-1和下游的mi RNA对下游m RNA表达及细胞功能的影响。结果:生物信息学分析筛选出hsa-mi R-494和IGF1-R作为circ EML5-1可能的靶基因及信号通路。RIP、Pull down、双荧光素酶报告系统实验证明circ EML5-1可以海绵吸附mi R-494。mi R-494在PCOS原代细胞中低表达。在KGN中可以抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。而circ EML5-1可以显著降低mi R-494在KGN细胞中的表达,并负性调控其促凋亡作用。双荧光报告系统实验证明mi R-494和IGF1-R可以结合。q PCR结果显示,mi R-494可以显著降低KGN细胞中IGF1-R m RNA的表达水平,而mi R-494下调可以部分回复circ EML5-1沉默后IGF1-R蛋白表达的抑制作用,及对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结论:circ EML5-1通过circ EML5-1/mi R-494/IGF1-R网络调控颗粒细胞的增殖和调亡,可能参与PCOS的发生发展。