炔雌醇(Ethinyl estradiol,EE)是一种人工合成雌激素,被用于调节女性正常生理周期、辅助受孕等。目前很多动物和人群研究已经发现围孕期特别是孕前母体内环境对子代的生长发育有影响,因此,我们拟观察孕前EE暴露对子代青春期生殖发育的影响并探讨其中机制。本课题采用孕前EE暴露SD大鼠动物模型,以子代阴道开口和阴茎剥离时间(大鼠进入青春期的标志)为观察终点,研究孕前EE暴露对子代大鼠青春期生殖发育的影响,其后,我们进一步对产生这种影响的具体机制进行探讨。结果发现孕前EE暴露能够影响子代进入青春期的时间,影响子代下丘脑ARC区与青春期启动相关通路中NKB、kisspeptin、GPR54、Leptin R、Insulin R的mRNA及蛋白的表达,影响母体内雌激素的代谢水平。因此我们认为孕前EE暴露通过影响母体孕期体内雌激素的代谢,导致子代青春期生殖发育异常的发生,从而提示孕前也是值得关注的内分泌干扰的重要时期,女性在非孕期服用含有EE的药物对其后续怀孕计划造成子代青春期生殖发育健康问题应该得到重视。第一部分孕前EE暴露对子代大鼠青春期生殖发育的影响目的利用雌性SD大鼠孕前炔雌醇(EE)暴露模型,研究母代孕前EE暴露对子代大鼠青春期生殖发育的影响。方法(1)建立大鼠模型:雌性SD大鼠随机分成4组,每组10只,对其进行EE灌胃暴露15天,4个剂量组为:芝麻油对照组、50μg/kg、200μg/kg、800μg/kg。暴露结束15天后进行合笼受孕,孕鼠所生子鼠同组间经过窝别的随机交换,避免窝别因素作为干扰因素。(2)观察子鼠一般生长发育状况:不同时间点体重变化、各脏器系数。(3)观察子鼠青春期性发育状况:雌鼠阴道开口时间、发情周期变化,雄鼠阴茎剥离时间,血清性激素水平。结果1.孕前EE暴露对子代雌鼠青春期生殖发育的影响(1)子代雌鼠阴道开口时间组间比较具有显著性差异(p<0.05)。与对照组相比,200μg/kg组开口时间显著推迟,50μg/kg组子代雌鼠阴道开口时间有推迟的趋势,800μg/kg组有阴道开口时间提前的趋势。对其出生体重具有显著差异,特别是50μg/kg组出生体重显著下降,青春期启动时体重并无显著差异,但至其P60天龄时体重组间比较是有统计学差异,特别是高剂量800μg/kg组体重显著升高。(2)对照组子代雌鼠有正常的发情周期,暴露组大鼠发情周期的长度显著性增加,发情间期增加,发情期减少。发情周期的各个阶段顺序紊乱,不能形成规律的发情周期变化。(3)与对照组相比,暴露组子代雌性大鼠血清雌激素水平并无显著变化,但血清中leptin水平有显著变化,特别是200μg/kg、800μg/kg显著下降。(4)各脏器系数中,暴露组大鼠肾/体重和卵巢/体重是有统计学差异。其中暴露组大鼠肾/体重显著下降,特别是50μg/kg、800μg/kg组较明显。卵巢/体重显著性升高,50μg/kg组较显著。肝/体重、脾/体重、子宫/体重没有显著性的改变。2.孕前EE暴露对子代雄鼠青春期生殖发育的影响(1)母代孕前EE暴露显著影响了子代雄性大鼠青春期启动时间(p<0.001),50μg/kg组子代雄鼠阴茎剥离时间显著推迟,而200μg/kg和800μg/kg组阴茎剥离时间提前,其中800μg/kg组差异显著。孕前EE暴露显著影响了子代雄鼠的出生体重,尤其是50μg/kg组出生体重显著下降,对其青春期启动时体重并无显著改变,但P60龄时暴露体重上升,特别是高剂量组800μg/kg组体重显著升高。(2)与对照组相比,暴露组子代雄鼠血清睾酮和leptin水平并无显著性变化。(3)子代雄鼠的各脏器系数中,EE暴露组大鼠肝/体重、肾/体重和睾丸/体重都是显著下降。脾脏并无显著性变化。结论1.孕前EE暴露显著的改变了子代进入青春期的时间,200μg/kg组的子代雌鼠青春期启动年龄显著推迟,50μg/kg组子代雄鼠的青春期启动年龄显著推迟,而800μg/kg显著提前,这说明不同EE剂量对青春期启动的效应不同,这种效应具有性别差异。经孕前EE暴露子代雌性大鼠进入青春期后其发情周期紊乱,发情周期的长度增加。实验结果说明母代孕前EE暴露能够影响子代出生后青春期的生殖发育。2.孕前EE暴露会影响子代的出生体重,在青春期启动体重子代大鼠都没有差异,但随着其生长到P60龄时,暴露组出现了体重增加的效应。说明母代孕前EE暴露导致子代成年后体重的增加。3.孕前EE处理对子代肝、肾以及睾丸和卵巢脏器具有显著影响。这说明母代孕前EE暴露不仅会对子代生殖系统脏器有影响,而且对肝、肾这样的代谢器官也有影响,这种影响也许会间接影响生殖系统。第二部分孕前炔雌醇暴露导致子代青春期启动紊乱的机制探讨目的基于第一部分的实验结果,从代谢通路与神经内分泌通路对母代孕前EE暴露对子代大鼠青春期生殖发育所造成的影响机制进行探讨。方法(1)母鼠EE暴露处理同第一部分,对母鼠的体重进行了观察记录。在暴露结束后对母鼠进行了糖耐量实验,观察EE暴露是否会影响母鼠的糖代谢。利用代谢笼对暴露前、暴露结束后第1天、暴露结束后第15天、怀孕第7天、怀孕第14天、怀孕第21天的尿液进行收集,用代谢组学方法对其体内雌激素代谢水平进行分析。记录每组子鼠的出生只数。(2)对子鼠在青春前期P21、青春后期P50时进行了糖耐量水平实验,测定时间点分别为0,15min,30min,60min,120min[1]。(3)对子鼠P60下丘脑ARC区中kiss1、GPR54、Lep R、Ins R、NKB与青春期启动相关的关键基因及蛋白进行RT-PCR/Western Bolt分析。结果1.EE暴露对母代糖代谢的影响(1)EE暴露后暴露组母鼠的体重有下降的趋势,但并无显著差异(2)糖耐量实验结果显示EE对母鼠的糖代谢无显著影响。(3)对每组的母鼠产仔数进行统计分析也无显著差异。2.孕前EE暴露对子代青春期糖代谢的影响(1)孕前EE暴露对子代雌鼠青春期糖代谢的影响:暴露组青春前期P21糖耐量水平在0,15min,60min,120min有显著性变化,而在青春后期P50时只有30min有显著性差异。(2)孕前EE暴露对子代雄鼠青春期糖代谢的影响:暴露组与对照组相比较,青春前期P21糖耐量水平是显著性改变的,特别是50μg/kg组在0,15min,30min,60min显著上升,在120min时恢复与对照组相一致。而在P50时暴露组与对照组相比较均无显著差异。3.孕前EE暴露对子代下丘脑ARC区与青春期启动相关通路中关键基因及蛋白表达的影响(1)子代雌鼠ARC区PCR结果显示Lep R、kiss1、NKB、Ins RmRNA的表达组间比较有显著差异,200μg/kg组Ins R mRNA显著下调,800μg/kg组NKB mRNA显著上调。GPR54 mRNA的表达并无显著差异,但有上调的趋势。(2)Western Bolt结果显示暴露组子代雌鼠kisspeptin,GPR54,Lep R,Ins R,NK3R的表达均有显著差异。暴露组与对照组相比Kisspeptin,Ins R蛋白的表达显著上升,Lep R的表达下降。GPR54蛋白在50μg/kg组显著上升,而在800μg/kg组显著下降,在200μg/kg组并无显著差异。NK3R蛋白在50μg/kg和800μg/kg组的表达显著下降,而在200μg/kg组显著上升。(3)子代雄鼠ARC区mRNA表达结果显示与对照组相比,暴露组kiss1、Ins R mRNA表达水平是有显著差异的,对Lep R、GPR54、NKB mRNA的表达水平影响不大。200μg/kg组kiss1 mRNA显著上调,50μg/kg组Ins R mRNA显著下调。(4)Western Bolt结果显示子代雄鼠ARC区kisspeptin,GPR54,Lep R,Ins R,NK3R的蛋白表达均有显著差异。暴露组与对照组相比Kisspeptin,Ins R,Lep R的蛋白表达均是显著下降的。GPR54蛋白在50μg/kg和200μg/kg组显著上升,而在800μg/kg组显著下降。NK3R蛋白在50μg/kg和800μg/kg组的表达显著下降,而在200μg/kg组显著上升。4.用代谢组学方法分析孕前EE暴露通过影响母体内孕期雌激素代谢致子代青春期生殖发育异常尿液分析结果显示EE暴露后第一天以16α-OHE1,2-Me OE2,4-OHE2,4-OHE1,4-Me OE2上升,Pregnenolone下降。经过15天的洗脱期后16α-OHE1,4-OHE1,2-OHE1上升,4-Me OE2,Progesterone下降,暴露的影响还是很明显的。在经过15天洗脱期16α-OHE1,4-OHE1的上升没有改变,说明EE暴露对羟基代谢影响较大。在孕末16α-OHE1,4-OHE1上升,这和一开始暴露出现的现象一致,提示对羟基代谢可能产生延续效应,实验组孕期的E1是全程下降的。实验发现在母代孕期雌激素中的E1、2-Me OE1、2-Me OE2、4-OHE2、4-Me OE1、Progesterone以及17α-OHprogesterone代谢水平与子代雌鼠的青春期启动时间具有相关性;孕期E1、16α-OHE1、4-OHE2代谢水平与代雄鼠的青春期启动时间具有相关性。结论1.EE暴露对母鼠的体重、糖代谢以及其产仔数并无显著影响,这和文献[2]中报道的服用EE的妇女其体重和糖代谢并无改变是一致的。2.孕前EE暴露会影响子代青春前期的糖耐量水平,但到其青春后期糖代谢逐渐恢复正常。3.孕前EE暴露会影响子代下丘脑ARC区与青春期启动相关通路中关键基因及蛋白的表达水平。在基因水平上主要影响kiss1,Ins R,NKB,LepR mRNA的表达,对GPR54 mRNA的表达略有影响。在蛋白表达水平上暴露组相比于对照组蛋白水平表达均有显著差异。蛋白和mRNA表达趋势不一致可能是因为转录后修饰或者翻译过程的调控与修饰改变的原因。4.尿液雌激素代谢组学分析结果显示EE暴露对母鼠体内雌激素代谢的改变影响还是比较显著的,特别是对羟基的代谢具有延续效应,会影响到孕期母体内雌激素的代谢。我们从母体内环境雌激素代谢水平,结合了子代下丘脑中的代谢信号与神经内分泌信号这样的目的基因和蛋白分析了孕前EE暴露影响子代青春期生殖发育的机制。