论文部分内容阅读
谷氨酸受体(glutamate receptor)在植物的生长发育、代谢调节以及信号传导等方面发挥着重要的调控作用。AtGLRs属于拟南芥的谷氨酸受体家族,类似于动物中的iGluRs。拟南芥谷氨酸受体有三个亚族,AtGLR3.4属于第三个亚族。AtGLR3.4可以通过Ca2+信号机制,快速响应机械胁迫和冷胁迫等外界刺激,从而响应外界环境信号。然而,过去对AtGLR3.4的研究大多采用体外实验,不能实现活细胞中AtGLR3.4的原位检测。除此之外,前人对植物AtGLR3.4在质膜上的时空分布动态关注较少,并且对响应逆境胁迫早期事件的研究尚不清楚。本研究运用可变角度全内反射荧光显微术(variable angle-total internal reflection fluorescence microscopy,VA-TIRFM)和激光扫描共聚焦显微术(laser scanning confocal microscopy,LSCM)等技术,并结合生化技术和细胞生物学方法,对配体处理后,拟南芥幼苗AtGLR3.4蛋白在细胞膜上的动力学行为,以及影响AtGLR3.4蛋白动力学的因素进行了比较深入的研究。主要结果如下:(1)通过Glu、GABA和GSH处理拟南芥幼苗,对幼苗的根表型进行观察和分析,发现不同配体Glu、GABA和GSH处理后根长变短。(2)运用VA-TIRFM技术,观察拟南芥幼苗叶表皮细胞AtGLR3.4动态特征,结果显示:AtGLR3.4在质膜上分布不均匀;通过MATLAB软件分析后发现,AtGLR3.4存在四种运动模式,其中定向运动最多,约占55%;寡聚化状态分析发现,AtGLR3.4以四聚体形式存在,然而不能排除存在单体、二聚体以及三聚体。不同配体处理后,AtGLR3.4蛋白动力学特征发生了变化:Glu、GABA处理后,AtGLR3.4蛋白扩散范围、扩散系数、运动速率、停留时间都增加:不同浓度GSH处理后,AtGLR3.4蛋白扩散范围、扩散系数、运动速率变小,停留时间增长,且该效应具有浓度依赖性的特点。(3)通过MATLAB软件追踪LatB、Oryzalin、MβCD和纤维素酶处理后的AtGLR3.4蛋白,探究了细胞壁、膜筏和细胞骨架对AtGLR3.4蛋白运动的影响,发现对AtGLR3.4蛋白动力学特征影响最大的是细胞壁,其次是膜筏,影响最小的是细胞骨架。综上所述,本研究应用VA-TIRFM技术、激光共聚焦显微技术以及其它细胞生物学和生化方法,在单分子水平上,对AtGLR3.4蛋白动力学特征进行了分析。研究发现:(1)AtGLR3.4在细胞质膜上的寡聚状态和定位是高度动态的;(2)不同配体Glu、GABA和GSH处理后,AtGLR3.4蛋白的运动特征发生明显变化,其中GSH处理后AtGLR3.4蛋白运动特征变化最显著,且该效应是浓度依赖性的;(3)通过探究影响AtGLR3.4蛋白运动的因素发现,对GLR3.4蛋白运动影响最大的是细胞壁,其次是膜筏,影响最小的是细胞骨架。这些结果揭示了不同配体处理后AtGLR3.4蛋白的动态变化规律及影响AtGLR3.4蛋白动力学特征的关键因素,为进一步阐明细胞膜蛋白的动态调控及信号传导机制提供了依据。