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结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染引起的慢性呼吸道传染病,世界上三分之一的人口已被感染,每年新发病例接近九百万例,它在世界范围内传播、发病是其盛行的原因之一。pe/ppe基因占据结核分枝杆菌基因组编码区的10%,PE/PPE蛋白家族中一些成员被鉴定为是毒力因子,参与宿主免疫反应,但大部分PE/PPE蛋白的确切功能还需要探索,其中包括PPE25、PPE27和PE19蛋白。本研究利用原核体系表达和纯化获得的PPE25、PPE27、PE19蛋白与小鼠巨噬细胞RAW264.7相互作用以初步解析其生物功能。此外,为以后更深入地研究该家族蛋白的功能和在机体免疫调节中的作用,成功构建了带有FLAG标签的重组穿梭表达载体pMV261-ppe25,并电转化至无毒快速生长的耻垢分枝杆菌,从而获得重组菌株。1.结核分枝杆菌PPE25、PPE27和PE19蛋白对巨噬细胞RAW264.7细胞因子和死亡方式的影响纯化获得重组蛋白PPE25.PPE27和PE19,去除内毒素后经过鲎试剂测定内毒素含量,BCA法测定蛋白浓度。按照浓度0、1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,作用24 h后,用Cell Proliferation ELISA BrdU (Colorimetric)试剂盒检测细胞活性,发现PPE25、PPE27和PE19对RAW264.7的活性有显著的抑制作用(p<0.05),且呈现剂量依赖性。重组蛋白以不同浓度作用于巨噬细胞RAW264.7,作用24和48 h采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞死亡方式。结果显示,PPE25、PPE27和PE19都导致RAW264.7发生细胞坏死,说明PPE25、PPE27和PE19蛋白都具有毒性。同时,应用液体悬浮芯片系统luminex200方法检测不同浓度的重组蛋白PPE25、PPE27和PE19与RAW264.7相互作用后培养上清中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表达量的变化,从而评价PPE25、PPE27和PE19对RAW264.7炎性反应的影响。重组蛋白PPE25、PPE27和PE19分别以1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL的浓度刺激RAW264.7,作用24和48h后,与空白组相比,重组蛋白PPE25引起IL-6分泌量显著上调(p<0.05),TNF-α分泌量有所上升。重组蛋白PE19引起IL-6分泌量显著上调(p<0.05),TNF-α分泌量没有明显差异。然而重组蛋白PPE27引起IL-6分泌量显著下调(p<0.05),TNF-α分泌量也下调。此外,重组蛋白PPE25、PPE27和PE19促使巨噬细胞IL-1β表达量均低于检测线2.13 pg/mL,IL-12p40表达量均低于检测线2.09 pg/mL。这些差异表达证实重组蛋白PPE25、PPE27和PE19可以通过调控促炎性因子IL-6的表达引起巨噬细胞免疫应答。2.表达结核分枝杆菌ppe25基因的重组耻垢分枝杆菌的构建以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,采用PCR技术扩增ppe25基因序列并添加FLAG标签,以便Western-blot检测其表达。将PCR产物定向克隆到克隆载体pCR2.1,测序结果与GenBank公布的基因序列完全一致。经BamH I/EcoR I双酶切获得ppe25酶切片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,通过酶切及PCR鉴定正确后,将重组质粒pMV261-ppe25电转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态,构建、筛选重组耻垢分枝杆菌,命名为rMS-pMV261-ppe25。重组耻垢分枝杆菌的PCR和酶切鉴定表明构建正确。重组菌经45℃30min诱导表达,超声裂解后的Western-blot结果表明,目的蛋白与抗PPE25兔多抗血清和抗FLAG标签单克隆抗体发生特异性的反应,与预期条带大小39.51kD一致。