基因Ⅶ型新城疫病毒F基因在家蚕杆状病毒表达系统的表达

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【目的】新城疫(Newcastle disease,ND)是分布于全球是禽类的一种严重疾病,不但对家禽养殖带来巨大威胁而且会导致经济损失。基因VII型新城疫病毒F基因在家蚕杆状病毒表达系统中成功的表达,为进一步研究NDV抗原抗体检测试剂和新城疫基因工程疫苗奠定了基础。【方法】(1)对原始序列进行密码子优化后人工合成,是以Genbank中新城疫病毒F基因序列(登录号:HM74894)为基础的。本试验利用聚合酶链式反应技术,将对新城疫病毒F基因上651pb进行扩增,此区域为433~1083,有两个抗原位点编码217个氨基酸残基。PCR扩增的目的片段克隆到表达载体pET28a(+)上,经IPTG诱导表达,通过基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析,将亲和层析纯化的目的蛋白4次免疫小鼠,制备鼠源多克隆抗血清。(2)利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕5龄幼虫体内表达新城疫病毒F基因。将优化、合成的VII型新城疫病毒F基因克隆到杆状病毒转移载体pVL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与开放阅读框1629缺损的亲本病毒Bm-Bacmid DNA共转染BmN细胞进行同源重组后,将获得重组病毒接种5龄幼虫,进行目的蛋白表达。【结果】(1)通过酶切和基因测序表明目的基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,重组质粒在37℃0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后经电泳分析目的条带清晰,与预期结果一致。通过基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱分析表达的蛋白与理论序列一致。将纯化蛋白免疫小鼠获得多抗血清效价可达1:3200,可用于检测真核表达产物。(2)Western-blot杂交分析证明在感病的幼蚕血淋巴中可检测到分子质量约59ku的目的蛋白条带。【结论】(1)成功获得用于检测NDV真核表达产物的多抗;(2)利用家蚕杆状病毒表达系统成功表达基因VII型新城疫病毒F基因。本研究为下一步进行动物实验以及研究NDV基因工程疫苗奠定了基础。
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