论文部分内容阅读
目的:采用药理学,病理学,分子生物学,电镜等多种科研技术与方法,以探讨复方蛇龙胶囊降低大鼠肾性蛋白尿及对足细胞保护作用的机制。方法:以72只SPF级健康雄性大鼠为研究对象,随机取12只作为正常对照组,其余60只应用两次尾静脉注射阿霉素(ADR)的方法建立肾性蛋白尿的动物模型,经检测尿蛋白定量大于100 mg/24h者模型复制成功,随机分为模型组,阳性对照药组(雷公藤组)、复方蛇龙胶囊低、中、高剂量组。各组分别予灌胃给药,灌胃体积为2 ml/100g·d,雷公藤组以成人临床用量的5倍,即5 mg/kg·d作为大鼠给药剂量;低剂量组以成人临床药量的3.75倍(即相当于生药0.375 g/kg·d)作为大鼠给药剂量,中剂量组为成人临床药量7.5倍(相当于生药0.75 g/kg·d)作为大鼠给药剂量,高剂量组为成人临床药量15倍(相当于生药1.5 g/kg·d)作为大鼠给药剂量,正常组与模型组给予等体积的生理盐水。分别检测大鼠给药0周、2周、4周、6周、8周的24小时尿蛋白排泄量;连续给药4周,每组随机抽取大鼠6只,测定血浆总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯等生化指标,同时对肾皮质进行形态学观察;各组剩余大鼠继续给药至8周,依上法检测上述指标。以条件永生代小鼠肾足细胞MPC5为研究对象,利用CCK-8试剂盒的方法筛选ADR的造模剂量及复方蛇龙胶囊的试验剂量。分别在干预完成后,检测各组相关指标:利用RT-PCR和Western blot分别从基因和蛋白的水平检测足细胞特异性蛋白nerphrin、podocin、synaptopodin及凋亡因子cyt-C、caspase9、caspase3;在蛋白层面检测cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的表达水平;利用双抗体夹心法检测cAMP的水平;利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡;利用Jc-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化;利用比色法检测ATP水平;利用透射电镜对其进行形态学观察。结果:1.复方蛇龙胶囊可显著降低大鼠24 h蛋白尿排泄量,升高血浆总蛋白和白蛋白,降低总胆固醇和甘油三酯。同时,形态学观察表明:光镜下,正常组大鼠GBM结构完整,基质及系膜细胞未见增生。给药组与模型组相比,足细胞轻微肿胀,基质及系膜细胞可见轻度增生,肾小管管腔内可见少量蛋白管型,间质有轻微炎性细胞侵润;电镜下,空白组大鼠GBM完整平滑,无系膜细胞及基质增生,足突排列整齐,无融合,给药组优于模型组,其基质及系膜细胞增生较轻,仅见少量足突融合,肾小管细胞水肿较轻,线粒体肿胀变性程度较少,溶酶体减少。2.ADR造模剂量为0.25μg/ml,干预时间为24 h;确立复方蛇龙胶囊高中低剂量组,分别为100 ng/ml,75 ng/ml,50 ng/ml,干预时间为24 h。3.复方蛇龙胶囊可上调足细胞相关特异性因子nerphrin、podocin、synaptopodin基因水平及蛋白水平,抑制凋亡因子cyt-C、caspase9、caspase3基因水平及蛋白水平,抑制细胞凋亡,上调cAMP水平,减轻线粒体膜电位的下调,提高ATP水平。形态学观察表明:透射电镜下,给药组足细胞较模型组线粒体肿胀程度较轻,线粒体嵴排列紊乱程度较轻,溶酶体破裂程度较轻,粗面内质网脱颗粒程度减轻,核固缩程度较轻。结论:1.复方蛇龙胶囊可有效降低大鼠肾性蛋白尿的排泄量。2.复方蛇龙胶囊降低蛋白尿及对足细胞保护作用的机制可能是通过调节cAMP水平,调节下游蛋白CREB磷酸化,一方面维持足细胞特异性蛋白nerphrin、podocin、synaptopodin水平,另一方面维持线粒体结构与功能,抑制细胞凋亡,抑制线粒体膜电位的降低,提高ATP的含量而达到保护足细胞的作用,继而维护了滤过屏障的完整性,减轻蛋白漏出,从而达到降低蛋白尿的目的。