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研究背景与目的:慢性移植物抗宿主病(c GVHD)是异基因造血干细胞移植术后发生的严重并发症。间充质干细胞(MSCs)具有免疫调节作用,可通过上调Treg细胞比例来改善c GVHD。研究发现MSCs的免疫调节具有双向可塑性,表现为促进免疫或抑制免疫作用,其免疫调节的作用方向与MSCs所处的微环境、及TLR3和TLR4的表达相关。MSCs免疫调节的双向性决定了临床应用中治疗效果的异质性和不稳定性。MSCs主要通过细胞外囊泡(EVs)来发挥作用,MSCs来源的细胞外囊泡(MSC-EVs)具有与母细胞相似的免疫调节功能,由于无细胞结构,功能不受环境影响,稳定性好,安全性高,有可能替代MSCs成为新型的无细胞治疗方法。因此,定向诱导出具有高效、稳定的免疫抑制作用的MSCs及MSC-EVs具有重大的临床意义。IFN-γ联合促炎因子如IL-1α、IL-1β、TNF-α等可增强MSCs的免疫抑制作用。GVHD中血清IFN-γ和炎症物质LPS水平明显升高,是否有助于MSCs发挥免疫抑制作用?IFN-γ联合LPS刺激MSCs诱生MSC-EVs是否也能获得更强的免疫抑制作用?本研究将在体外模拟GVHD患者IFN-γ和LPS条件,探讨IFN-γ联合LPS刺激对MSCs及其诱生的MSC-EVs对PBMC中Treg比例的影响,并进一步在体内探讨IFN-γ联合LPS刺激MSCs诱生的MSC-EVs对GVHD的治疗作用。方法:1、取约10cm足月剖宫产新生儿脐带,应用Ⅱ型胶原酶消化贴壁法分离培养脐带华通氏胶来源间充质干细胞(h UC-MSCs),对第3代h UC-MSCs进行表面标志物表达的检测以及成骨、成脂诱导分化功能鉴定。本研究经广东省人民医院医学伦理委员会批准,脐带捐赠产妇者均签署捐赠知情同意书。2、体外将IFN-γ联合LPS刺激的h UC-MSCs与健康供者外周血单个核细胞(PBMC)进行直接和间接共培养,检测Treg的比例,并利用Trizol法提取共培养后h UC-MSCs的RNA,通过荧光定量PCR检测h UC-MSCs中TLR3和TLR4的m RNA表达水平。3、超速离心法提取MSC-EVs,通过透射电镜、Nanosight和Western blot对MSC-EVs进行鉴定。4、体外将IFN-γ联合LPS刺激的MSC-EVs与PBMC进行共培养,检测Treg的比例。5、建立人源化GVHD小鼠模型,随机分成三组:PBS对照组、未刺激的MSC-EVs治疗组、IFN-γ联合LPS刺激的MSC-EVs治疗组,观察各组小鼠的临床表现及生存情况,并检测Treg的比例。结果:1、经酶消化贴壁法成功分离培养人脐带华通氏胶来源的MSCs,第3代MSCs呈梭形或成纤维样贴壁生长,高表达CD105、CD90、CD73,低表达HLA-DR、CD45、CD34,并可诱导向成骨、成脂分化。2、无论是直接共培养还是间接共培养,IFN-γ联合LPS刺激的h UC-MSCs都可以提高Treg细胞的比例,且优于未刺激和IFN-γ或LPS单独刺激的h UC-MSCs组(IFN-γ联合LPS刺激组、未刺激组、IFN-γ单独刺激组和LPS单独刺激组Treg的比例分别是:直接共培养第5天——12.8±0.8%vs 10.7±1.2%vs 11.5±0.7%vs 8.7±1.2%,P<0.05;间接共培养第3天——15.9±1.6%vs 10.4±0.8%vs 12.6±1.2%vs 11.8±1.3%,P<0.01)。而且,在间接共培养体系下,IFN-γ联合LPS刺激的h UC-MSCs能更早地提高Treg细胞的比例。同时,IFN-γ联合LPS刺激可明显上调h UC-MSCs中TLR3的m RNA表达(IFN-γ联合LPS刺激组、未刺激组、IFN-γ单独刺激组和LPS单独刺激组TLR3的m RNA表达水平分别是1.38±0.32 vs 1 vs 1.1±0.1 vs 0.76±0.15,P<0.05),对TLR4的m RNA表达有升高的趋势(P=0.08),对TLR3/TLR4比值则未见明显影响(P>0.05)。3、超速离心法提取的MSC-EVs呈双凹圆盘状,有完整的双层膜结构,粒径范围为95.9nm-201.7nm,平均值为146.4nm,最高峰值为108nm,同时表达CD63,符合EVs的特征。4、IFN-γ联合LPS刺激的MSC-EVs与PBMC共培养,可明显提高Treg细胞的比例,且优于未刺激的MSC-EVs组(IFN-γ联合LPS刺激的MSC-EVs组、PBMC组和未刺激的MSC-EVs组Treg比例分别是:共培养第3天——27±1.2%vs 20.7±1.4%vs22.6±1.6%,P<0.01;第4天——13.4±1.7%vs 7.7±2%vs 9.9±0.9%,P<0.01)。5、在体内,IFN-γ联合LPS刺激的MSC-EVs可提高Treg细胞比例,改善GVHD临床症状,延长生存时间(PBS对照组、未刺激的MSC-EVs治疗组、IFN-γ联合LPS刺激的MSC-EVs治疗组的Treg比例分别是4±0.6%vs 10.9±1%vs 10.6±1.1%,P<0.05;生存时间(天)分别是55.8±8.8 vs 66±10 vs 66.2±8.2,P<0.05),但与未刺激的MSC-EVs治疗组相比无明显差异(P>0.05)。结论:IFN-γ联合LPS刺激MSCs诱生的MSC-EVs在体外可明显提高PBMC中的Treg细胞的比例,且优于未刺激MSC-EVs组;IFN-γ联合LPS刺激诱生的MSC-EVs在小鼠GVHD体内亦可上调Treg比例,改善临床症状,延长生存时间。