通常情况下,粮食中的肌醇和磷大多以植酸的状态存在。以植酸盐状态存在的有机磷酸化合物被称为植酸磷。动物要吸收饲料中以植酸磷状态存在的磷,只有将植酸磷催化成无机磷酸盐的形式。植酸酶属磷酸单酯水解酶,是最近几年出现的一种新型绿色添加剂,它通过催化过程,将植酸以及植酸盐催化成磷酸(或盐)和肌醇。有很多实验研究证明,使用植酸酶作为饲料添加剂时,磷的吸收率可被提高,无机磷的补充量被减少,同时动物粪便中无机磷的比重也下降;在饲料中植酸酶的加入能有效的抑制机体内的植酸与金属离子和蛋白质生成络合物,提高多种微量元素和蛋白质的利用率。天然来源的植酸酶普遍存在表达水平低、提取困难、成本高等问题,这些问题都导致其难以满足现实生产的需要。所以构建基因工程菌作为微型生物反应器来实现异源高水平分泌表达,成为解决这一问题的关键。通过基因工程手段能够解决天然植酸酶分泌量低及抗逆性和热稳定性差等问题。利用巴斯德毕赤酵母作为生物反应器诱导重组植酸酶表达的方法是最具有优势的,该方法操作简便、表达量大且适宜工业化生产。凭借微生物工程技术的不断发展,对植酸酶结构和功能的探索正逐渐的成熟与深化。本文对来源于Yersinia kristensenii的植酸酶基因YkAPPA进行改造,并成功实现了在大肠杆菌(Escherichia coli)EG60和毕赤酵母(Pichia pastoris)GS-115中异源表达,同时对其重组植酸酶相关酶学特性和动力学参数等进行了研究分析,主要研究结果如下:1.利用NCBI数据库公布的来源于Yersinia kristensenii(基因登录号为JQ394763.1)的植酸酶基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏爱性对目的基因进行优化,优化前与优化后的氨基酸序列完全一致。设计合成长度为60bp的小片段引物序列,利用PTDS基因合成技术合成了新的重组植酸酶基因YkAPPAS,重组植酸酶基因全长为1266bp,依据密码子偏好性将GC含量调整至51.9%。本实验获得的植酸酶YkAPPAS经过对比后发现,其氨基酸序列中含有植酸酶的最具保守的两个区域:分别是与植酸酶底物结合位点RHG×R×P和酶的催化中心HD。将合成的目的基因与pMD18-T载体连接克隆及测序,随后将测序成功的目的基因与表达载体相连,合成pYPX88-YkAPPAS载体。利用电击法将载体导入酵母GS-115中,筛选具有高活性的转化株,用终浓度为1%的甲醇诱导培养,发酵上清液中酶的分泌量可达到106.73μg/mL,完成了重组植酸酶YkAPPAS在毕赤酵母中的高活性、高产量的表达。在重组植酸酶YkAPPAS基因的5’端添加了6个His标记,所以利用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白的初步纯化后再利用Ni离子亲和层析分离出单一的植酸酶重组蛋白。聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组植酸酶YkAPPAS的蛋白分子量约为46kDa,实际结果与生物信息学预测理论值一致,说明YkAPPAS几乎没有糖基化现象的发生。2.将纯化后的重组植酸酶进行酶学特性分析,研究结果显示,其最适pH分别是pH4.5和pH6,pH3-pH12时的活性都在30%以上,最适温度在45℃,在100℃处理5min后其活性为47.55%,90℃处理5min后其活性为56.75%。EDTA及Mn2+对酶的活性有一定的激活作用;Cu2+以及Al3+、Pb2+、Zn2+等对酶活有一定的抑制作用,尤其是SDS抑制力最强。综上所述,本实验获得的相关酶活数据为应用基因工程和蛋白质工程等方法解决植酸酶分泌量少、活性低等问题提供了重要的借鉴和参考价值。