肝脏是人体腹腔内最大的实质性器官,肝损伤是引起肝脏疾病的主要原因,其中食品里的有害成分(如苯并(α)芘)引起的肝损伤不容忽视,对其研究可为预防肝病的发生提供科学依据。苯并(α)芘是油脂食品加工过程中产生的一种常见的多环芳烃类化合物,广泛存在于各种油脂食品中。苯并(α)芘除了是一种公认的致癌物外,还具有很强的免疫毒性、神经毒性以及生殖毒性;它可通过诱导细胞DNA损伤、线粒体功能障碍、氧化应激等诱发机体损伤,进而损害健康。细胞自噬是细胞在恶劣条件下确保其生存的基本应激反应,主要通过降解自身异常或过多细胞器和蛋白质来实现自身新陈代谢与更新平衡,细胞自噬失衡则会诱导细胞死亡。细胞焦亡是一种依赖caspase-1激活,进而伴有大量促炎症因子释放的细胞死亡方式。食品中的苯并(α)芘是否也可通过这两种方式损伤机体健康目前尚不明确。本文以苯并(α)芘为研究对象,选用人HL-7702肝细胞建立模型,利用生化技术,在细胞水平上探讨苯并(α)芘对HL-7702肝细胞活力、细胞自噬、细胞焦亡等方面的影响;并通过细胞自噬及焦亡抑制剂探究苯并(α)芘诱导人HL-7702肝细胞产生自噬及焦亡的关系。主要研究结果如下:(1)通过MTT、染色试验、流式细胞仪分析、荧光探针DCFH-DA检测等研究了苯并(α)芘对人HL-7702肝细胞活力的影响。结果表明,苯并(α)芘可极显著地影响人HL-7702肝细胞的活力,并具浓度和时间依赖性;50 μM的苯并(α)芘作用于HL-7702人肝细胞24 h和48 h后,细胞活力极显著地降低,仅有71%和75%。通过台盼蓝染色试验可以明显看出,经苯并(α)芘处理后细胞死亡率随苯并(α)芘的浓度升高而逐渐升高。流式细胞仪分析结果显示,苯并(α)芘可以将HL-7702人肝细胞的细胞周期阻滞在S期,晚期凋亡及坏死细胞的数量显著性增多,细胞内活性氧ROS水平显著性增加。由此可知,苯并(α)芘可以通过阻滞HL-7702肝细胞的周期、诱发细胞凋亡和细胞内活性氧增加的方式抑制HL-7702肝细胞增殖。(2)通过荧光染色、透射电镜等研究了苯并(α)芘对HL-7702肝细胞自噬的影响。AO和MDC荧光染色结果显示,经苯并(α)芘处理后的HL-7702肝细胞内AO和MDC荧光亮斑强度随苯并(α)芘处理浓度升高而逐渐增强;透射电镜结果显示,当苯并(α)芘的处理浓度增加时,HL-7702肝细胞中自噬泡的数量会逐渐增多,当苯并(α)芘处理浓度增加到50μM时,观察到了自噬泡吞噬高尔基体的现象;同时,苯并(α)芘处理HL-7702肝细胞后,自噬特征指标Beclin-1和LC-3表达量显著性增加,且呈现浓度依赖性。试验结果证明,苯并(α)芘可以诱导HL-7702肝细胞产生自噬性损伤,且自噬程度与苯并(α)芘处理浓度呈正相关关系。(3)通过生化技术及Westorn-blot等研究苯并(α)芘对HL-7702人肝细胞焦亡的影响。苯并(α)芘处理HL-7702肝细胞后,细胞相对电导率、NO释放量、LDH释放率显著性升高;同时苯并(α)芘可以显著提高HL-7702肝细胞内焦亡特征指标Caspase-1、COX-2、IL-1β、IL-18的蛋白表达量,且呈浓度依赖性。试验结果证明,苯并(α)芘可诱导HL-7702肝细胞产生焦亡性损伤,且焦亡程度与与苯并(α)花处理浓度呈正相关关系。(4)通过Westorn-blot等进一步探究了苯并(α)芘诱导HL-7702产生的细胞自噬和细胞焦亡之间的关系。HL-7702人肝细胞通过细胞自噬特异性抑制剂(3-Methyladenine)处理后,再经苯并(α)芘处理,其相对电导率、NO释放量、LDH释放率与苯并(α)芘单独处理组相比显著性延缓,且HL-7702人肝细胞内Caspase-1、COX-2、IL-1β、IL-18的表达量显著性降低;通过细胞焦亡特异性抑制剂(Ac-YVAD-CMK)处理后,AO染色发现,与苯并(α)芘单独处理组相比,细胞内荧光强度降低,HIL-7702肝细胞内Beclin-1和LC3蛋白表达量显著性降低。以上试验结果表明,当苯并(P)芘诱导的HL-7702肝细胞自噬被抑制时,其诱导的细胞焦亡也被抑制;与此同时,当苯并(P)芘诱导的HL-7702肝细胞细胞焦亡被抑制时,其诱导的细胞自噬也被抑制。说明苯并(P)芘可同时诱导HL-7702肝细胞产生细胞自噬和细胞焦亡,且二者相互促进。本研究较全面地研究了苯并(P)芘对HL-7702人肝细胞活力、细胞自噬和焦亡的影响,并深入探究了两者之间的关系,为深入揭示食品有害物质苯并(P)芘的毒性机制,建立高效完善的防范措施提供科学依据。