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目的:质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid-mediatedquinoloneresistance,PMQR)是近几年来发现的耐药机制,主要由耐药基因qnr(quinoloneresistance)介导。本文通过对临床分离超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)或AmpCβ-内酰胺酶(AmpC酶)大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中3类(qnr、aac(6')-Ib-cr、qepA)PMQR基因的检测,以了解PMQR基因的流行特征及对16种抗生素的耐药特点,为控制PMQR菌感染提供资料。
方法:
1肠杆菌科细菌的分离与鉴定324株大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌分离于河北医科大学第二医院、河北医科大学第四医院、白求恩国际和平医院、石家庄市第一人民医院、保定徐水人民医院、沧州市第一人民医院及石家庄市中心医院。其中大肠埃希菌139株,肺炎克雷伯菌108株、阴沟肠杆菌77株。标本来源:痰液140株、尿液77株、血液18株、分泌物17株、穿刺液7株、脑脊液5株以及其它标本60株。对收集到的菌株先转种于血琼脂培养基上,再用肠杆菌科鉴定系统API20E进行复核鉴定,确保鉴定菌株种属的准确性。
2细菌的耐药性及耐药酶的检测对分离的菌株采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行了16种抗菌药物的敏感性测定;采用双纸片协同试验检测了ESBLs携带情况,采用抗菌药物及抑制剂组合耐药表型筛选法检测了AmpC酶的携带情况。
3qnr基因的检测采用聚合酶链反应(PCR)方法,对产ESBLs或AmpCβ-内酰胺酶的菌株进行喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、aac(6')-Ib-cr、qepA检测,对琼脂糖凝胶电泳阳性产物进行测序,测序结果应用GenBanK-Blast、Dnaman软件上网比对,确认所测基因。
结果:
1大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌产ESBLs或AmpC酶的检测324株细菌产ESBLs或AmpC酶共115株,其中29.3％为单产ESBLs酶,2.79％为单产AmpC酶,3.40％为产ESBLs+AmpC酶。115株产酶菌的构成比为:大肠埃希菌中37.4％为单产ESBLs、1.44％为单产AmpC酶、4.31％为产ESBLs+AmpC酶;肺炎克雷伯菌中30.5％为单产ESBLs、1.85％为单产AmpC酶、0.92％为产ESBLs+AmpC酶;阴沟肠杆菌中13.0％为单产ESBLs酶、6.49％为单产AmpC酶、5.19％为产ESBLs+AmpC酶。
2产ESBLs、AmpC酶的菌株对16种抗生素的耐药情况115株产酶菌对环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率分别为86.1％和70.9％对第一、二、三、四代头孢的耐药率均在80％以上,对于β-内酰胺酶抑制剂合剂中的头孢哌酮/舒巴坦耐药率较低,为14.1％、哌拉西林/他唑巴坦和阿莫西林/克拉维酸的耐药率分别为18.8％和29.6％。对氨基糖甙类抗生素阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为30.4％和73.9％。亚胺培南、美罗培南的耐药率为0。
3qnr阳性菌株在产ESBLs或AmpCβ-内酰胺酶大肠埃希菌、肺炎克伯菌和阴沟肠杆菌的分布情况115株产ESBLs或AmpCβ-内酰胺酶大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌我们共检测到18株qnr基因阳性菌株。在阳性菌株中大肠埃希菌2株(1.73％),其中1株为痰标本,另1株为血标本;肺炎克雷伯菌12株(10.43％),7株为痰标本,2株为尿标本,2株为分泌物,1株为脑脊液;阴沟肠杆菌4株(3.48％),尿液、痰液、分泌物、深静脉导管各1株。
4六种耐药基因检出情况:
115株产ESBLs或AmpCβ-内酰胺酶大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的PCR产物经琼脂糖电泳分析,共检出含qnr阳性菌株18株(15.6％)。其中qnrA1株(0.87％)、qnrB12株(10.4％)、qnrS1株(0.87％)、aac(6')-Ib52株(45.2％)、qepA2株(1.73％)。同时携带qnrB和aac(6')-Ib基因的为7株,同时携带qepA和aac(6')-Ib的为2株,未检出qnrC基因。
5序列分析
经对qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、aac(6')-Ib和qepA进行测序,检出12株qnrB基因,45株aac(6')-Ib基因,未检出qnrA、qnrS、qnrC和qepA基因。qnrB和aac(6')-Ib测序结果经GenBank-Blast和Dnaman()件序列分析与qnrB4(GenBnk注册号DQ303921)和aac(6')-Ib(GenBnk注册号Eu886978)的同源性分别为99％、98％,未发现aac(6')-Ib-cr。
结论:
1产ESBLs或AmpC酶和qnr基因携带可能是我省部分地区大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌耐药的主要原因之一。
2体外试验显示碳青霉烯类抗生素和含有酶抑制剂的复合抗生素抗菌活性较好。
3我省的临床分离的肠杆菌科细菌中,质粒介导的喹诺酮类耐药基因以qnrB为主。Qnr基因可以在细菌中水平传播,应加强对qnr基因的监测。