[背景]肠道病毒(Enteroviruses, EV)是生活在人类肠道中的一类常见病毒,多为无症状感染,但也可引起多种严重的或潜在的致死性疾病如脊髓灰质炎、脑炎、手足口病、出血性结膜炎和急性心肌炎等。近年的研究还表明,EV感染与某些慢性疾病有关,如Ⅰ型糖尿病、甲状腺炎等。EV在世界范围内广泛分布,无明显地域性差异。随着当前各国间国际交流日益频繁,EV流行范围早已超过人们最初的预期,并且自然界中EV生存环境的改变很可能会加速病毒的变异。EV所致疾病主要为散发或呈地区性暴发。在非流行期,特定区域通常有几个优势型别共循环,而在暴发时期,往往会在同一地区分离到大量同一型别毒株。长期以来,EV感染是严重威胁公众特别是儿童健康与生命安全的重大公共卫生问题之一,加强EV分子流行病学监测,对于预防控制EV相关疾病具有重要理论和实际意义。EV以隐性感染为主,隐性感染者可持续数周向外环境排泄大量病毒,故EV常在下水道污水、江河水中检出,甚至污染饮用水水源。环境中的EV可以通过不同的实验方法进行浓缩、分离及鉴定,以作为EV流行病学研究的一个补充方法,称为环境监测。生活污水是特定地区EV在环境中的丰富来源。环境监测可以获得特定地区EV的循环信息,包括有症状的感染和隐性感染,并有可能在人群产生临床症状之前就在生活污水中检出EV。EV在环境水体中广泛存在,可在多种环境水体中被分离,但其滴度相对较低,且容易在水中悬浮物上附着,比临床标本更难检出。因此,环境水体标本检测前必须进行大量水体的浓缩富集,这是决定EV能否成功分离的关键环节。膜吸附-洗脱法是目前实验中应用最广泛的浓缩方法,在病毒的环境监测以及相关疾病的病原体检测方面可以发挥很大作用。EV是相关领域研究的热点之一,近年来对其进行了广泛的流行病学及病毒学研究。目前,全球已有相当数量的国家开展环境生活污水标本的监测研究,以了解当地脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus, PV)和非脊灰肠道病毒(Non-polio Enteroviruses, NPEV)的循环状况和开展相关研究,而国内在该领域研究较少。[研究目的]1.在前期研究的基础上,继续优化环境生活污水标本中EV的浓缩分离方法,以完善方法学,提高检测效率；探讨污水标本中悬浮颗粒物对病毒吸附和分离的影响。2.通过环境监测和病例监测,明确2012～2014年山东地区EV型别分布、传播和频率,为相关疾病的流行病学研究提供支持。3.补充完善山东省环境生活污水标本EV分离株各型别的VP1区基因数据库,研究山东省EV的基因特征和长期循环动态变化,为EV分子流行病学研究提供有价值的补充。[研究方法]1.环境监测：本研究选择济南市光大污水处理厂、临沂市首创水务公司作为采样点,之后在2013年9月又纳入烟台市辛安河污水处理厂作为采样点,分别在其生活污水的入口处采用定时采样法采集污水标本,使用阴离子膜吸附-超声波振荡法进行浓缩富集,接种RD和Hep-2细胞进行病毒分离。2.病例监测：本研究选择山东省2012～2014年急性弛缓性麻痹(AFP)和急性脑膜炎脑炎综合症(AMES)两种疾病监测系统中分离的EV进行分析。3.基因扩增及型别鉴定：提取病毒RNA,使用RT-PCR扩增VP1编码区,对阳性产物进行序列测定。将各分离株的VP1编码区序列通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的数据库比对,进而确定EV血清型别。4.生物信息学分析：使用BioEdit 7.0.9.0软件,对生活污水和病例标本中的EV分离株以及GenBank中公布的相关EV VP1核苷酸序列进行同源性比较。使用MEGA 5.0软件,通过邻位法(Neighbor-joining Method)构建系统发生树,建树的可靠性通过1000Bootstrap评估。通过比较,研究山东地区EV的基因特征、变异及其进化来源。[主要结果]1.阴离子膜吸附洗脱法的优化：通过加标回收试验,比较不同pH值洗脱液和不同超声波振荡次数对EV的回收率,确定最优洗脱条件为：洗脱液pH为9.0,超声振荡时间设定为振荡1次,持续3min。2.环境污水中悬浮颗粒物对EV的吸附作用：环境污水为酸性时,有利于EV吸附到悬浮颗粒物上；EV含量对悬浮颗粒物的吸附作用基本没有影响。环境污水中悬浮颗粒物浓度增加,吸附到颗粒物上的病毒滴度及吸附率呈上升趋势,吸附在其中的病毒的洗脱率呈明显下降趋势,总体的颗粒物回收效率在特定的浓度范围内保持稳定。环境污水标本中悬浮颗粒物对E-3的吸附作用较强,对E-6的吸附作用较弱。3.环境监测和病例监测标本的采集和病毒分离情况：2012～2014年环境监测标本共分离到EV 2010株,包括NPEV 1468株,优势血清型别为E-7、CV-B5、 E-6、E-3、E-11、CV-B3; PV542株,其中发现1株Ⅱ型疫苗衍生株脊灰病毒(VDPV)E12-221,以及12株高变异株病毒(pre-VDPV).各市不同月份的NPEV型别谱各有不同,不同血清型别的毒株有不同的时间循环模式。AFP监测病例共分离到NPEV119株,包括27种型别；PV 35株,未检出VDPV毒株及PV野毒株。2014年AMES监测病例中,收集标本798份,分离到EV 152株,阳性率为19.1%。其中,CV-B5、E6、E-30分离数目较多,占总分离数的92.8%,还分离到E-7、E-25及1例E-3与E-6的混合感染。4.EV优势血清型别的同源性比较和系统进化分析：E-7分离数目最多,分离株之间同源性较低,存在多个传播链共循环。E-3核苷酸和氨基酸变异较小,在遗传进化上较为稳定,具有明显的时间和地域聚集性。CV-B5分离株之间同源性较高,存在两个传播链,在山东省内传播迅速,广泛流行。CV-B3分离株之间核苷酸差异较小,进化分支具有明显的时间聚集特征。E-6分离株核苷酸差异较大,保持着较快的进化速度,山东省内存在至少两条传播链的共循环。E-11分离株包括Gergory-like和Silva-like毒株,分为明显的两个进化分支,之间的核苷酸差异较大。[主要结论]1.根据加标回收试验结果,通过优化洗脱液pH值、超声振荡时间和次数,确定了污水标本的阴离子膜吸附-超声波振荡法的最优洗脱条件。2.环境污水中悬浮颗粒物对EV具有较强的吸附作用,并受到多种因素的影响,其分离型别构成与上清中差异不大,但各血清型别分离率存在差异。建立了从悬浮颗粒物中洗脱浓缩EV的方法。在今后的环境监测中,应综合采用污水上清和悬浮颗粒物进行分离分析。3.环境监测和病例监测中主要分离到的是EV-B组病毒,A组、C组病毒分离株数较少。NPEV分离株的优势血清型别为E-7、CV-B5、E-6、E-3、E-11、 CV-B3。各市不同月份的NPEV型别谱各有不同,不同血清型别的毒株有不同的时间循环模式。4.环境污水中分离到的PV均为疫苗株,无野病毒。国内首次从环境污水中发现疫苗衍生株脊灰病毒。5.山东省EV各优势血清型分离株进化速度较快,变异活跃,存在多条传播链的共同流行,环境监测与病例监测优势株之间存在一定的遗传进化关系。6.环境监测对EV具有较高的敏感性,能够获得外环境中EV的流行情况和时间循环模式,也可以作为AFP监测系统之外评估人群中PV流行的一种补充手段,为预防控制相关疾病提供科学依据。