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由于缺少真核蛋白所需要的后加工机制,常用宿主大肠杆菌的应用范围受到了很大限制。然而,在大肠杆菌中,重要的工业用酶青霉素G酰化酶能够完整地表达,产生具有生物活性的成熟酶。从最初形成的前体肽到最终的成熟青霉素G酰化酶,需要经过复杂的后翻译过程,包括前体肽的合成,切除信号肽跨越质膜,水解连接肽重折叠成为具有α、β两亚基的活性酶。本文对影响青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的表达和后翻译调控的一系列因素进行了深入的研究,并在此基础上,确立了适于规模化的一步纯化和渗漏发酵方法。
首先对来源于克鲁沃尔氏菌属(Kluyvera citrophila)的青霉素G酰化酶在BL21(DE3)中表达的发酵条件进行了系统的研究。通过对不同条件下蛋自表达情况和酶活的分析,证实了PGA的后翻译效率是得到活性酶的关键所在。最终确定的条件为:复合培养基YE作为发酵培养基,起始pH7.0,装量30 mL,30℃培养。在此条件下,菌浓、总酶活及单位酶活分别达到16.25、25090U/L,和1544 U/L/OD600。
重点研究了诱导条件对外源蛋白表达和后翻译的影响,首次提出推迟诱导时机可提高PGA后翻译效率的观点。无论采用何种培养基培养,在细胞生长旺盛的对数期诱导,虽有较高的蛋白表达量,但成熟效率下降,最终产量减少。而在生长速率减缓的稳定期开始诱导,则可最大限度地促进PGA的成熟,提高活性PGA的产量。具体诱导时间的选择与培养基的组成及细胞的生长状态密切相关。复合培养基中胞内蛋白水解作用是限制PGA产量的重要因素。此外,诱导浓度过高也会导致表达和成熟效率的下降。
研究中发现二价金属离子中的钙、镁离子对BL21(DE3)生长和PGA表达有显著影响。当YE培养基中加入24 mM钙离子时,菌浓和PGA总酶活可达17.55和32920 U/L,分别为对照的2.38和6.57倍,而单位酶活的最高值2040 U/L(对照的3倍)需要钙离子浓度增至100 mM才能达到。加入2 mM镁时,菌浓、PGA总酶活和单位酶活均达到最高值17.31,34260U/L和1979 U/L/OD600,分别为对照的2.93倍、7.6倍和2.59倍。诱导时加入钙可暂时性地提高PGA从胞内向周质空间的转运能力,但对总酶活的产生没有明显的促进作用。无论在何时加入镁离子,OD都有明显的上升,且倾向于达到最大菌浓。金属离子被EDTA螯合时,重组菌的生长受到严重抑制,诱导时加入EDTA则导致包涵体的聚集,说明金属离子是PGA后翻译过程所必须的。
本研究发现在镁离子存在的情况下,外源蛋白PGA的表达不仅未对宿主菌产生不利影响,反而对其生长有很大的促进作用,这与传统的质粒存在带来代谢负担的观点相反。单纯在培养基中加入PGA不能产生同样的效果。出现该现象的原因可能是,在外源基因PGA的表达过程中,宿主菌经历了某些对其生长有利的生理变化,进而导致其最终菌浓提高。为简化后期提取工艺,尝试了青霉素G酰化酶的一步纯化。发现在本实验条件下该目标蛋白不能螯合于亲和柱上。通过硫酸铵分级沉淀可得到29.1 U/mg的比酶活,纯化倍数为3.54。采用渗透休克法得到了较好的效果,条件优化后92%的PGA可释放到胞外,且纯度大于80 %,完全达到了工业用酶的要求。酶学性质研究表明,KcPGA的最适作用pH和温度分别为pH 7-9和50℃,在pH 5.0—8.0和低于40℃的范围内比较稳定。
本文还确立了青霉素G酰化酶的渗漏发酵策略,在诱导3小时后添加3%(v/v)的氯仿时,82.9%的PGA可释放到发酵液中,加入氯仿后,细胞的形态由原来的均匀悬浮状态变为絮凝状,对后期的固液分离更为有利。