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[目 的]甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)目前已成为我国在册吸毒人员滥用最多的毒品种类,严重威胁社会安定并带来沉重的医疗负担,其中肠道出血、梗阻等并发症引起的肠源性感染具有高发病率、高猝死率的特点,不仅是社会问题还是十分重要的公共卫生问题。甲基苯丙胺导致的肠道损伤并发症发病机制极其复杂,氧化应激损伤是主要的机制之一。在多种坚果、植物中发现槲皮素(Quercetin,Que)具有抗炎、抗氧化、抗增殖等多种作用,但其抗氧化肠道保护作用机制研究较少。本研究基于Nrf2信号通路,应用激动剂叔丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone,TBHQ)和抑制剂全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA),探讨槲皮素对甲基苯丙胺导致肠道氧化损伤的影响及可能机制,为甲基苯丙胺的氧化性损伤机制研究和Nrf2信号通路在槲皮素对甲基苯丙胺肠道氧化损伤中的影响和作用机制提供新的实验依据,为后续进行动物实验和研究开发槲皮素相关新药应用于临床,以及对甲基苯丙胺肠道损伤并发症的治疗提供新的思路和途径。[方 法]以小鼠小肠上皮细胞(MODE-K细胞)为研究对象,通过细胞培养技术将其分为以下五组,分别是:1.对照组(METH:0mM,Control组)、2.甲基苯丙胺组(METH:1.5mM,METH组)、3.激动剂+甲基苯丙胺组(TBHQ:10μM+METH:1.5mM,TBHQ+METH 组)、4.抑制剂+甲基苯丙胺组(ATRA:10μM+METH:1.5mM,ATRA+METH 组)、5.槲皮素+甲基苯丙胺组(Que:50μM+METH:1.5mM,Que+METH组)。进行相应预处理1.5h后,再行甲基苯丙胺干预24小时。用CCK-8法检测甲基苯丙胺和槲皮素对MODE-K细胞损伤的细胞存活率并确定干预浓度,应用倒置相差显微镜观察干预后各组细胞形态,AnnnexinV/PI双染色法检测各组细胞凋亡率,DCFH-DA荧光探针检测细胞氧化指标活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,TBA法检测细胞内脂质氧化物质丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,qRT-PCR 技术和 Western Blot技术检测细胞内Nrf2、HO-1、CAT、NQO1、SOD1等Nrf2信号通路关键基因及其蛋白的表达水平。[结 果]1.CCK-8实验发现,甲基苯丙胺干预小鼠小肠上皮细胞后12h、24h、36h和48h四个时间段中与对照组相比,细胞存活率差异有统计学意义,且随着甲基苯丙胺干预剂量增加,各个时间段MODE-K细胞存活率逐渐降低,呈现出剂量-时间-效应关系。通过计算分析得出半数抑制浓度IC50,本次实验中所使用的的甲基苯丙胺的剂量为1.5 mM,干预24h。再分析不同浓度槲皮素对MODE-K细胞的存活率,为排除槲皮素自身对细胞的影响,本实验Que预处理剂量为50μM。2.加入Nrf2信号激动剂TBHQ预处理后再行METH干预,与未加TBHQ组相比,同一剂量组细胞存活率有所增加,且当METH浓度为1.5mM时差异有统计学意义;若加入Nrf2信号抑制剂ATRA预处理后再行METH干预,与未加ATRA组相比,同一剂量组细胞存活率有所降低,且当METH浓度为1.5mM时差异有统计学意义。3.在倒置相差显微镜下观察各组处理后MODE-K细胞的变化,Control组细胞胞体丰满胞质向外铺展,细胞突起伸出较长,贴壁牢固生长良好且增殖生长的细胞连接成网状。METH组细胞形态发生明显改变,原有细胞突触变短甚至消失整体形态回缩变圆,细胞碎片产生增多且漂浮数量显著增加。经Nrf2激动剂TBHQ预处理后再行METH干预发现,细胞存在突触仍可见基本形态,细胞浓缩变圆且漂浮细胞数量减少。经抑制剂ATRA预处理后再行METH干预发现,细胞变圆程度和漂浮细胞更显著,且部分细胞脱落,产生大量的细胞碎片。而经Que预处理后再行METH干预发现,仍可见细胞基本形态,与METH组相比浓缩变圆及漂浮细胞数量减少。4.各组干预后用流式细胞分析仪进行细胞凋亡检测,与对照组相比,METH能够使MODE-K细胞进入早期凋亡或者晚期凋亡;加入Nrf2激动剂TBHQ后,凋亡数量较METH组减少;加入Nrf2抑制剂ATRA后,凋亡数量较METH组增加。而经过Que预处理后,凋亡数量较METH组显著减少,细胞凋亡水平降低。5.经DCFH-DA荧光探针结合后,在荧光倒置显微镜下直接观察各组细胞内ROS水平,再收集各组细胞用流式细胞分析仪对ROS表达量进行检测。与对照组相比,给予甲基苯丙胺干预MODE-K细胞后,METH组ROS含量增加;激动剂TBHQ预处理后细胞中的ROS含量较METH组降低,且与Control组相比无统计学差异;抑制剂ATRA预处理后细胞中活性氧含量较METH组升高,且与对照组相比差异具有统计学意义。而经Que干预后ROS含量较METH组水平降低,与Control组相比无统计学差异。6.TBA法检测各组细胞内MDA水平发现,甲基苯丙胺干预后与对照组相比,METH组MDA含量增加;激动剂TBHQ预处理后再行METH干预细胞中的MDA含量较METH组降低;ATRA抑制剂预处理后再行METH干预较METH组MDA含量升高,差异具有统计学意义。而经Que干预后MDA含量较METH组降低,差异具有统计学意义,且与Control组相比无统计学差异。7.利用RT-qPCR和Western blot方法检测甲基苯丙胺对MODE-K细胞以及激动剂TBHQ、抑制剂ATRA预处理后再行甲基苯丙胺干预对MODE-K细胞中Nrf2信号通路中关键基因和蛋白的表达。实验组Keap 1和Nrf2总蛋白、mRNA表达量均无显著统计学差异;与METH组相比,细胞核蛋白Nrf2表达随着加入激动剂TBHQ预处理后增加,而加入抑制剂ATRA后减少。与Control组相比,实验组各组中HO-1、CAT、NQO1、SOD1蛋白和mRNA的表达水平均升高,差异有统计学意义;激动剂TBHQ+METH组HO-1、CAT、NQO1、SOD1蛋白和mRNA的表达增加,而抑制剂ATRA+METH组CAT、NQO1蛋白和mRNA的表达量减少,差异具有统计学意义;但ATRA+METH组中HO-1、SOD1蛋白和mRNA的表达量与甲基苯丙胺组相比无统计学差异。再通过与Control组相比,槲皮素干预后上调了下游HO-1、CAT、NQO1等关键蛋白和mRNA的表达,提高细胞内SOD1含量,促进ROS的清除。[结 论]1.甲基苯丙胺可激活MODE-K细胞中Nrf2信号通路。2.Nrf2信号通路在槲皮素对甲基苯丙胺致MODE-K细胞损伤中的保护作用机制可能是通过上调Nrf2信号通路下游相关基因的表达来发挥抗氧化作用。