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液相色谱-串联质谱技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS),具有高选择性、高灵敏度、高通量、操作简便以及多成分分析等优点,已经成为小分子药物研发各个阶段不可或缺的定量技术手段。近年来,LC-MS/MS技术在抗体蛋白等生物大分子药物研发中也占有越来越重要地位,成为配体结合分析法的补充方法。生物样品预处理方法在很大程度上决定了LC-MS/MS分析方法的通量、灵敏度、准确性和重现性等。随着LC-MS/MS技术的发展及应用范围的扩大,生物样品预处理方法的开发也面临着诸多挑战。本论文针对几种理化性质不同的小分子药物,研究不同的生物样品预处理技术对LC-MS/MS定量分析的影响,提出生物样品预处理的解决方案。本文中采用的样品预处理方法主要包括:盐析辅助液-液提取;柱前衍生化;柱前还原;固相萃取技术。目前上述LC-MS/MS分析方法均以建立、验证并成功应用于几种药物的临床或非临床研究中。 a)高通量盐析辅助液-液提取预处理方法应用于人血浆中阿托伐他汀及其主要代谢物LC-MS/MS分析 阿托伐他汀(atorvastatin,AT)是一个羟甲戊二酰辅酶A选择性抑制剂。AT在体内CYP酶作用下代谢为邻羟基阿托伐他汀(ortho-hydroxyatorvastatin,o-OAT)和对羟基阿托伐他汀(para-hydroxyatorvastatin,p-OAT)。AT、o-OAT和p-OAT结构中含有羟基羧酸(carboxylate,CAR)结构,它们在体内也可脱水形成内酯型(lactone,LAC)代谢物。在血浆样品采集、处理、提取、等分析过程中,AT及羟基代谢物CAR型与LAC型的会发生相互转化,影响浓度测定。本文建立了一个简单的盐析辅助液-液萃取预处理方法。使用了冰冻的的6M醋酸铵和乙腈做为提取试剂,确保提取体系的低温状态,并控制pH在6左右,有效抑制CAR型与LAC型相互转化。SALLE提取时间仅为1 min,各待测物的提取回收率均高于81%。同分异构体o-OAT和p-OAT在Kinetex XBC18柱上以梯度模式洗脱,在2.2 min实现色谱分离。质谱检测使用了电喷雾电离源和(+MRM)扫描模式,监测的离子反应为m/z559.3→m/z440.2(AT)和m/z575.3→m/z440.2(o-OAT和p-OAT)。本文建立的LC-MS/MS法测定AT、o-OAT和p-OAT的血浆浓度线性范围分别为是0.0200-15.0 ng/mL、0.0200-15.0 ng/mL和0.0100-2.00 ng/mL。精密度、准确度等各项指标均符合生物分析指导原则。本法成功应用于阿托伐他汀片人体生物等效性研究。 b)固相萃取柱上衍生化法用于人血浆中米诺膦酸超灵敏LC-MS/MS分析 米诺膦酸(minodronic acid,MA)是第三代双膦酸盐(bisphosphonate,BP)抗骨质疏松药物。与其他BP类药物相比,MA活性更高,临床给药剂量更低。这导致该药物的体内暴露量极低,达峰血浆药物浓度约为200 pg/mL。为了研究MA人体药动学,需建立超灵敏的血浆样品检测方法。BP结构中都含有两个强极性膦酸基,在反相色谱柱上不保留,质谱分析时易产生多电荷离子,不适合采用LC-MS/MS直接测定。本文以三甲基硅重氮甲烷为衍生化试剂,将膦酸基团活泼氢甲基化处理,降低其极性,增加色谱保留。LC-MS/MS检测衍生化产物时,发现与其他已报道的BP类药物分析方法不同,除了四甲基衍生化产物,MA经衍生化处理可生成五甲基衍生化产物。MRM色谱图显示,五甲基衍生物具有更好的信噪比,适合做为定量目标物。本文选择D4-MA为内标,与MA相比D4-MA的衍生化产率和重现性较差。推测原因是芳香杂环上的氢原子被氘代,降低了芳杂环氮原子的反应性。这使同位素内标的校正作用大大降低。为了提高同位素内标的衍生化效率,开发了SPE柱上两轮衍生化预处理法。血浆样品经WAX SPE柱提取后以三甲基硅重氮甲烷衍生化后,用甲醇洗脱产物。之后收集洗脱液重新上样于同一SPE柱,进行第二轮衍生化处理。 本文建立的柱前衍生化LC-MS/MS法测定米诺膦酸定量下限可达10.0pg/mL。线性范围为10.0-1000 pg/mL。各浓度水平日内、日间精密度(RSD)均小于1.7%,准确度(RE)在-2.8%~5.0%之间。该方法成功应用于健康受试者口服1.0 mg MA的药动学研究。给药后平均达峰浓度为289±256 pg/mL,达峰时间为1.92±0.78 h。本方法灵敏度足以测定给药后24小时后中血浆MA浓度。 c)柱前还原法应用于恒河猴血清中T-DM1释放DM1的LC-MS/MS分析 T-DM1是一种抗体药物偶联物,结构中包含单克隆抗体、Linker和小分子细胞毒化合物DM1。后者的血浆暴露量与T-DM1毒性相关,因此需监测其血中浓度。DM1结构中含有巯基,容易与血中的蛋白半胱氨酸残基形成二硫键,影响浓度测定。本研究中使用二硫苏糖醇作为还原剂,将氧化型DM1还原后使用蛋白沉淀法提取。提取液以乙腈-5 mM乙酸铵-甲酸为流动相以梯度洗脱模式色谱分离。采用配备有电喷雾电离源的串联质谱、以正离子扫描方式进行检测。用于定量分析DM1和内标左炔诺孕酮的离子反应分别为m/z738.2→m/z547.2和m/z313.2→m/z245.2。猴血清中DM1在0.100~100 ng/mL浓度范围内线性关系良好,方法提取回收率大于92.7%。该方法被应用于研究抗体-药物偶联物T-DM1在恒河猴体内毒动力学特征。 d)固相萃取法应用于人血浆中伊立替康及其主要代谢物LC-MS/MS分析 伊立替康(CPT-11)为DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂,在体内羧酸酯酶作用下水解为SN-38发挥药效。SN-38在体内葡萄糖醛酸转移酶1A1作用下生成葡萄糖醛酸结合物(SN-38-G)。CPT-11、SN-38和SN-38-G结构中含有LAC基团,在体内水解为CAR型代谢物。LAC型和CAR型在体内浓度处于动态平衡状态。为了减少CPT-11临床使用中的不良反应,高靶向脂质体制剂成为研究热点。研究脂质体制剂药物动力学,关键是测定非脂质体药物及代谢物。 本文采用SPE法分离脂质体型和非脂质体型药物。为了防止LAC和CAR型待测物相互转化,样品处理过程中应严格控制温度和pH。色谱分离选用中性缓冲溶液做为流动相。为防止CAR型源内环合为LAC,质谱检测去簇电压设置为60 V或以下。为提高分析结果的重现性和准确性,每种待测物均使用氘标记化合物做为内标。目前无市售SN-38G-LAC同位素标记物。本文以D3-SN-38-LAC为原料,通过体外生物学方法制备了D3-SN-38G-LAC。本法测定CPT-11-CAR和CPT-11-LAC浓度范围均为1.50~1000 ng/mL;测定SN-38-CAR和SN-38-LAC浓度范围均为0.100~10.0 ng/mL;测定SN-38-G-CAR和SN-38-G-LAC浓度范围均为0.400~40.0 ng/mL。分析方法经过完整验证后应用于伊立替康脂质体人体药动学研究。本研究成功建立同时分析6种不稳定化合物分析方法,该分析方法灵敏、准确、可重现、而且具有较好的分析通量,色谱运行时间为3.8 min。 生物样品预处理是LC-MS/MS分析方法的重要组成部分,本文选择四种药物AT、CPT-11、MA、DM1,生物分析面临着稳定性、灵敏度低等问题。本文针对不同问题从样品预处理方法开发的角度提出了各自的解决方案,以满足准确性、灵敏度和通量的要求。