随着我国老龄化社会的加剧,临床上骨缺损的修复将面临极大的挑战。目前大段骨缺损主要以自体骨修复作为“金标准”,但自体骨来源有限,限制了其发展;异体骨、异种骨会产生免疫排斥反应,引起炎症,加大感染等风险。近年来,组织工程的研究与发展为大段骨缺损提供了一个新的途径——进行人工器官移植,其原理是将种子细胞和材料支架在体外构建出与机体组织结构及功能相似的人工组织或器官,植入病损部位来实现修复病损部位的组织或器官。由于骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有来源稳定、取材方便、在一定的诱导条件下可向多种类型的细胞分化的优点,可作为组织工程骨的理想种子细胞。但是如何体外快速、有效的扩增足够数量的BMSCs是组织工程骨应用于临床需要解决的问题之一。组织工程骨支架材料需要具有良好的生物相容性、可加工性、可降解性、降解产物对机体无毒副作用以及具有合适的力学性能。羟基磷灰石(HA)材料具有良好的生物相容性与骨传导性。聚己內酯(PCL)材料具有良好的延展性能和可降解性,将两者结合制备HA/PCL复合材料作为组织工程骨支架材料有着广泛的应用前景。但是将种子细胞接种于支架材料中如何保持BMSCs的活性从而形成骨组织仍然是组织工程骨所面临的问题。极低频脉冲电磁场(pemf)属于一种非电离辐射,作为一种非侵入式物理疗法已经应用于临床,在修复骨损伤或治疗骨质疏松等骨科疾病方面取得了显著的疗效。研究显示,pemf一方面促进成骨细胞增殖和分化形成骨组织,另一方面通过改善患区的微环境来促进骨质生成。但是能否将pemf应用到组织工程骨种子细胞的体外扩增来促进组织工程骨形成还是一个未知的结果。目的:通过检测pemf对骨组织工程种子细胞——bmscs增殖、成骨分化的影响,以及检测pemf对接种于骨支架材料ha/pcl中的bmscs活性、增殖、分化和矿化情况的作用,为组织工程骨的种子细胞体外快速、有效的扩增提供实验观测依据。方法:1.从sd大鼠骨髓中分离、提取bmscs,体外培养bmscs至第3代bmscs做为组织工程骨的种子细胞;2.将种子细胞种植于通过双层盐析法制备的ha/pcl三维多孔复合材料支架上,观察支架材料中bmscs的活性;3.在二维条件下,系统研究不同磁感应强度及作用时间电磁参数组合的pemf对bmscs增殖和分化的影响,从而为后续研究确定最佳参数;4.pemf对接种于ha/pcl三维多孔材料支架中的bmscs的细胞骨架、活性、增殖和分化的作用。结果:1.体外提取分离的原代bmscs形态呈长梭形,培养至第3代能诱导向成骨和成脂细胞分化,流式结果显示细胞表面标记物cd29、cd90、cd44表达阳性,cd34表达阴性。2.通过双层盐析法制备ha/pcl三维多孔复合材料支架,体式显微镜、电镜观察可见支架孔隙率高,孔与孔之间的连通性好。bmscs接种后发现,bmscs在粘附、生长方面表现良好,细胞形态没有发生改变仍呈现长梭形,并能向孔内迁移。3.pemf对体外培养的第3代bmscs连续每天处理1h,发现频率为15hz,磁场强度为1mt的pemf对bmscs的增殖与碱性磷酸酶(alp)活性均有促进作用。4.pemf处理有助于接种在ha/pcl材料支架中bmscs保持其活性和长梭形形态,并显著地促进其增殖与矿化的能力,rt-pcr结果也显示对成骨细胞基因表达有促进作用。结论:频率为15Hz、磁感应强度为1mT的PEMF可以显著的促进骨组织工程的种子细胞——BMSCs的增殖和成骨分化,而且能够保持BMSCs在HA/PCL支架材料中的活性和长梭形形态,并促进BMSCs在支架材料中增殖、分化和矿化的能力。PEMF可以快速、有效的促进BMSCs体外扩增并向成骨分化,因此本研究建立了一种快速、安全、有效的组织工程骨种子细胞扩增的新方法,这为解决组织工程骨的种子细胞体外扩增提供实验观测依据,也为进一步完善电磁场的生物效应提供理论依据。