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目的:确定电离辐射引起的线粒体DNA损伤情况,定量检测电离辐射后线粒体DNA突变累积量,最后在整体层面分析电离辐射引起的线粒体功能变化及其与细胞命运改变间的关系。
材料与方法:1.建立Long PCR方法检测线粒体DNA损伤;2.使用realtime PCR和直接测序法检测线粒体DNA突变;3.通过流式细胞术检测线粒体功能相关指标,包括线粒体数量、膜电位、活性氧生成等;4.Western Blot检测相关信号通路蛋白表达;5.试剂盒检测ATP生成、细胞老化、细胞凋亡等。
结果:1.分别在人肿瘤细胞、大鼠,小鼠、斑马鱼中建立了准确检测线粒体DNA损伤的方法;2.电离辐射能够引起线粒体DNA4977大片段缺失的短暂积累;3.使用克隆筛选结合直接测序法检测发现电离辐射引起的线粒体DNAD310区点突变能稳定累积在存活细胞中;4.确定电离辐射引起的线粒体功能改变及其与细胞命运的关系。
结论:1.肿瘤细胞中线粒体DNA比核DNA对电离辐射更敏感,其损伤更为严重;2.电离辐射引起的线粒体DNA突变受选择压力影响,中性突变更容易得以保留;3.电离辐射引起的线粒体功能变化与细胞的遗传背景相关,线粒体功能影响细胞命运。