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肝脏是人体内最大的消化腺,发挥重要的生理功能。正常情况下肝再生不明显,当肝脏受到损伤时,则表现出强大的再生能力,这对于急、慢性肝损伤后肝脏修复具有重要的意义。参与肝再生的细胞种类与肝脏受损的状态(如受损原因、炎症轻重、肝纤维化程度等)密切相关：当轻度受损时,主要以肝实质细胞的增殖修复为主;当肝脏损伤严重或慢性肝损伤时,肝实质细胞增殖受抑制,则以肝干细胞激活、增殖和分化为主。肝卵圆细胞(Hepatic oval cell,HOC)被认为是主要的肝干细胞,正常情况下,肝脏中肝卵圆细胞非常少;当肝脏受损严重、正常肝实质细胞增殖被抑制时,肝卵圆细胞被激活,进一步增殖、分化为肝细胞和胆管上皮细胞,以完成肝脏的修复和再生。大鼠2-AAF(2-acetylaminofluorene,2-乙酰氨基芴)/PHx(Partial Hepatectomy,部分肝切除术)模型是最常用的肝卵圆细胞诱导模型,在这个模型中肝细胞增殖被2-AAF抑制,部分肝切除术后肝再生通过肝卵圆细胞增殖分化完成。多年来对肝再生机制的研究主要集中在细胞因子、化学信号传导通路方面。近年来,血流力学信号在肝再生机制研究方面的作用逐渐受到人们的重视。从肝再生的精细调节过程来看,门静脉血流变化似乎是启动、维持,甚至是终止肝再生过程的重要因素。但是肝再生是一个极其复杂的过程,涉及多种因子和信号通路的共同调控,其具体机制尚未完全阐明。部分肝切除术后,肝脏微环境血流力学改变可能通过细胞外基质与细胞之间的力学相互作用调控肝再生。黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)介导的“细胞外基质(ExtracellularMatrix,ECM)-整合素-细胞骨架(Cytoskeleton,CSK)”信号途径被认为是力学信号转导的关键通路,FAK被认为是该力学信号通路的启动子,是不同机械力作用于细胞启动力学信号传导的关键点。力学作用下,FAK被激活,将力学信号通过整合素、细胞骨架转导至细胞内,进一步激活下游信号通路,参与细胞增殖过程。我们前期的研究(国家自然科学基金,项目编号:40110011,应力刺激对肝再生的影响及其Ras/MAPK信号途径调节机制的研究)发现:大鼠部分肝切除术后,门静脉压力变化、力学信号传导通路关键蛋白FAK表达量和肝组织中增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)表达量三者之间呈正相关关系,说明部分肝切除术后流体应力变化可能通过力学信号通路关键蛋白FAK刺激肝细胞增殖。在肝脏受到严重损伤或慢性损伤时,肝干细胞参与肝再生过程,血流力学变化对肝卵圆细胞增殖和分化的影响尚不清楚,本课题拟对这一问题进行研究。[目的]本实验拟建立SD(Sprague Dawley)大鼠2-AAF/PHx肝卵圆细胞增殖诱导模型,动态测量门静脉压力(Portal Venous Pressure,PVP)值,半定量免疫组化分析肝组织中CK19、PCNA表达量的变化(PCNA可反映细胞的增殖活性,CK19可作为肝卵圆细胞的标记物),探讨血流力学变化对大鼠肝卵圆细胞增殖活性的影响。[方法]1.SD大鼠2-AAF/PHx动物模型的建立及实验分组1.1以SPF级雄性SD大鼠为研究对象,共24只,体重250±25g,饲养温度约25℃,相对湿度约60%,光照时间12h/d,自由饮水、摄食;1.2大鼠随机分为A、B、C、D组,每组6只,按每只20mg/(kg·d)2-AAF连续灌喂6天,第7天A组进行假手术,只游离肝周韧带;B组行30%肝切除术,C组行50%肝切除术,D组行70%肝切除术;术后第1天,继续灌喂2-AAF(剂量同术前)至术后3天结束。2.门静脉压力测定及肝组织标本的免疫组化检测术后72h再次腹腔注射麻醉下,沿上腹部切口进腹,门静脉穿刺标尺法测量门静脉压力(PVP)值(单位:cmH2O)。颈椎脱臼处死大鼠后留取肝组织标本,立即放入10%中性甲醛,固定24h,常规石蜡包埋、切片,PCNA和CK19免疫组化染色检测。3.检测指标统计各组大鼠门静脉压力值;肝组织标本免疫组化结果,每张切片随机选择相邻的5个视野采图,用Image-pro plus 6.0医学图像分析软件分别检测每张病理图片中免疫组化染色阳性的平均光密度值(IOD),表示CK19、PCNA的相对表达量。4.统计学分析测量结果以平均数±标准差(x±s)表示,实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行方差分析,两两比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.各组门静脉压力(PVP)值变化随着肝切除比例的增加,门静脉压力逐渐增大,方差分析总体比较差异具有统计学意义(F=100.214,P<0.05);各组之间相互比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.PCNA表达量变化随着肝切除比例的增加,PCNA表达量逐渐增加,方差分析总体比较差异具有统计学意义(F=32.825,P<0.05);70%肝切除术组PCNA表达量最显著,与其余各组之间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);50%肝切除术组与对照组比较,差异也具有统计学意义(P<0.05),但没有70%肝切除术组与对照组比较差异显著;30%肝切除术组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.CK19表达量变化随着肝切除比例的增加,CK19表达量也逐渐增加,方差分析总体比较差异具有统计学意义(F=13.072,P<0.05);70%肝切除术组CK19表达量最显著,与其余各组之间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);50%肝切除术组与对照组比较,差异也具有统计学意义(P<0.05),但没有70%肝切除术组与对照组比较差异显著;而30%肝切除组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]对照组、30%肝切除术组、50%肝切除术组、70%肝切除术组随着肝切除比例的增加,门静脉压力逐渐升高,肝卵圆细胞的增殖活性(PCNA、CK19表达量)也逐渐增强。其中70%肝切除术组中肝卵圆细胞增殖活性最显著,与其余各组比较差异具有统计学意义;50%肝切除术组与对照组比较差异也有统计学意义,但差异没有70%肝切除术组与对照组比较显著;而30%肝切除术组与对照组比较,肝卵圆细胞增殖活性差异无统计学意义。说明门静脉压力增加达一定程度时,血流力学增加可促进肝卵圆细胞的增殖,但是肝卵圆细胞增殖活性除了与血流力学变化相关外,可能与肝脏损伤的轻重程度也相关,其具体的作用机制还需要进—步研究。