胞苷单磷酸激酶（Cytidine monophosphate kinase,CMK）是核苷一磷酸激酶家族的重要成员,在核苷酸合成代谢中起关键作用。CMK催化胞嘧啶核苷一磷酸（Cytidine monophosphate,CMP）转化为胞嘧啶核苷二磷酸（Cytidine diphosphate,CDP）,再生成胞嘧啶核苷三磷酸（Cytidine triphosphate,CTP）,是CTP合成重要的一种酶。课题组前期发现CMK的热稳定性差,影响了催化合成3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose,3’-SL）的酶促反应效率。本研究通过理性设计的改造手段对CMK进行分子改造并考察对热稳定性的影响,主要研究结果如下:（1）根据在线服务器Po PMu Si C和软件Py Mo L预测分析氨基酸残基突变位点,使用定点突变技术成功构建了14个单点突变体。热稳定性分析实验结果表明,获得5个热稳定性提高的突变体。野生型酶（WT）保留了22.3%的残余酶活,这5个突变体Q30G、P62R、E85I、D148W和K165L残余酶活分别为35.5%、31.0%、34.9%、34.7%和36.9%。将突变体Q30G、E85I、D148W、K165L进行复合突变,获得热稳定性提高的突变体Q30G/E85I/K165L,其残余酶活是WT的2.2倍。（2）本研究通过B-FITTER预测和分析选择了11个氨基酸残基突变位点,实验结果表明,突变体N77H、Q79N和R173S的热稳定性高于WT。对突变体N77H、Q79N、R173S进行组合突变,成功获得热稳定性提高的突变体N77H/R173S,其残余酶活是WT的2.1倍。（3）依据Disulfide by Design的预测分析,结合定点突变技术,最终成功构建7个引入二硫键的突变体。与WT的残余酶活相比,突变体V72C/Q79C的残余酶活提高了0.8倍。（4）为了进一步提高CMK的热稳定性,将上述获得热稳定性提高的优势突变体进行复合突变,结果表明热稳定性提高最佳的是突变体Q30G/E85I/K165L。将cmkQ30G/E85I/K165L基因构建到前期研究的3’-SL的催化工艺中,在25 m L的催化体系中,产率提高了33.6%。本研究表明利用理性设计的改造方法可以提高CMK的热稳定性,对CMK的工业应用具有积极意义。