论文部分内容阅读
前言卵巢癌是妇科肿瘤中一种死亡率很高的肿瘤,它的高致死性主要是由于卵巢位于腹腔深部,在发病的早期很难检测到,往往到了晚期阶段才被发现,耽误了最佳的治疗时间,此时治疗的有效性不高。卵巢癌中80%—90%都是起源于卵巢表面上皮细胞。大量的流行病学调查证明妊娠次数多,时间长,哺乳时间长,以及口服避孕药等因素都会降低患卵巢癌的风险。这些保护因素与排卵的暂时停止和周期性的激素改变密切相关。促性腺激素理论认为:高浓度的促性腺激素FSH和LH有助于卵巢癌的发生发展:卵巢组织长期暴露于高浓度的促性腺激素的环境中,使得卵巢上皮细胞遭受促性腺激素长期持续的刺激,最终导致卵巢癌的发生。促性腺激素往往是通过其受体转导刺激信号,导致下游的一系列分子发生生化或病理改变,因此促性腺激素受体在卵巢癌的发病中也同样发挥着很重要的作用。本课题通过转染构建有FSH受体的质粒进入卵巢肿瘤细胞,研究FSHR及其相应配体在卵巢癌发生中的作用。通过检测促性腺激素受体FSHR和LHR在人体腹腔中的分布,进一步的阐明促性腺激素及其受体在卵巢癌发生发展中所起的作用。虽然FSH和LH具有很多相似的生物学特性,但它们也存在许多不同,我们前期的研究发现FSH具有促进细胞增殖的作用,而LH对细胞增殖没有显著性的影响,但LH能抑制FSH对细胞增殖的作用。因此本课题深入地研究了其具体的分子机制,为了解促性腺激素及其受体在卵巢癌的发生发展中的作用提供实验依据。第一部分过表达FSHR对卵巢癌上皮性肿瘤细胞的增殖和侵袭等细胞生物学行为的影响目的通过细胞转染技术,筛选出稳定高表达FSHR的MCV152细胞。观察FSHR的过表达对卵巢上皮性肿瘤细胞增生、侵袭和恶性转化以及细胞周期的影响。方法脂质体法把FSHR基因导入MCV152细胞中,通过G418筛选得到FSHR高表达的细胞克隆,并利用实时荧光定量PCR和Western blot对过表达的细胞克隆进行鉴定。在此基础上应用Western blot和Real time PCR检测相关蛋白和原癌基因的表达变化,利用MTT法检测细胞的增殖变化,并进一步的通过Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果通过筛选获得了高表达FSHR的细胞株(暂定为MF),其mRNA表达量是转染前的4.5倍,蛋白表达量上调到对照的5倍。FSHR的过表达使得细胞增殖能力和侵袭能力明显增强,细胞周期和部分原癌基因的表达也发生改变。小结MCV152细胞株FSHR的高表达可增强细胞的增殖和侵袭能力,并可增加部分原癌基因EGFR等的表达。第二部分促性腺激素受体在女性腹腔中的分布目的:本实验通过检测促性腺激素受体在腹腔中的分布情况,评价促性腺激素受体以及其配体的分布与临床上观察到的卵巢肿瘤在腹腔中的分布之间的关系,从而进一步的了解促性腺激素及其受体在卵巢癌发生中的作用。方法:收集病人卵巢上皮细胞,输卵管伞端和距离卵巢不同距离的腹膜,提取RNA,逆转录成cDNA,然后通过Real time PCR检测FSHR和LHR在腹腔中的分布。结果:从输卵管伞端到距离卵巢距离增加的腹膜中,FSHR的分布呈递减的趋势,而LHR的变化没有见到有明显的变化。小节:本实验结果提示,FSHR及其相应配体呈一定的分布趋势,从而说明卵巢肿瘤的发生可能是在促性腺激素的作用下在原发部位发生发展起来的。第三部分促性腺激素对卵巢上皮性肿瘤细胞的作用及其分子机制目的:研究促性腺激素导致卵巢上皮性肿瘤发生的分子机制和相关的信号通路。方法:通过MTT的方法检测FSH和LH对细胞增殖的作用;通过蛋白组学的方法检测两种促性腺激素对蛋白表达的影响,运用免疫印迹的方法进一步的确认蛋白组学的结果,并且通过该方法进一步测定所涉及的信号通路;并运用SiRNA干扰技术检测相关蛋白分子之间的影响。结果:FSH促进细胞增殖,而LH没有明显的作用;LH显著的上调prohibitin,MMPs的表达;当沉默掉prohibitin后,MMPs的表达也降低。FSH对prohibitin的表达没有影响。MMP-9具有促进卵巢癌细胞增殖的作用,MMP-2没有发现具有该生物功能。MMP-9能够抑制prohibitin对细胞增殖的负调控作用。小节:FSH和LH对细胞的不同影响可能跟它们对prohibitin的不同调节是密切相关的。Prohibitin对细胞增殖的抑制作用与MMPs对细胞的促增殖作用的相互中和抵消可能是LH对细胞增殖没有明显作用的分子机制。