研究背景：肿瘤坏死因子-α（TNF-α，tumor necrosis factor-α）是一种炎症因子，近10年的研究结果已证明它参与心力衰竭的发展过程，抑制TNF-α的活性能有效控制心力衰竭的进展。其作用机制目前尚未完全明确，现有的研究证明，TNF-α通过诱导心肌肥厚、细胞凋亡，抑制心脏收缩力等，参与心肌病变的进展。TNF-α在正常心肌中不能被检测到，因此其在病理情况下的表达调控，成为研究心肌病变发展的一个方向。本研究通过环缩SD大鼠腹主动脉增加左室后负荷，观测压力负荷对心脏TNF-α表达调控的影响，并观察它和心肌肥厚的关系；在心肌细胞培养水平，观察促心肌肥厚的神经内分泌活性介质去甲肾上腺素（NE）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对心肌细胞TNF-α表达调控的影响；并研究观察具有抑制TNF-α作用的中药814对心肌的作用，对814的心肌毒理学进行部分研究。材料方法：1．选雄性SD大鼠30只，体重180-200g，8周龄。手术组18例，无菌条件下打开腹腔，分离腹主动脉，在右肾动脉上方沿腹主动脉放置直径0.7mm的银夹，关闭腹腔。假手术组大鼠12只，仅在上述部位分离腹主动脉，不放置银夹。分别在术后1、3个月末进行M型超声心动图检查，于左室长轴切面测量IVSTd，LVPWd，LVEDd，计算LVMI，评价左室肥厚。心脏取材固定、HE染色后，测定室壁厚度和心肌横截面积。采用免疫组化染色方法检测心肌中TNF-α含量。2．原代培养新生SD大鼠心肌细胞，用10^-1M NE、10^-7M AngⅡ分别孵育心肌细胞24、48小时，采用免疫组织化学染色在蛋白质水平定性分析心肌细胞中TNF-α的合成，利用RT-PCR半定量分析TNF-α在mRNA水平的变化，评价上述刺激因素对心肌细胞表达TNF-α的影响。3．凝胶滞留实验（EMSA）：10^-5M NE、10^-7M AngⅡ孵育心肌细胞24小时，提取培养心肌细胞核蛋白，EMSA筛选TNF-α基因5’上游核苷酸序列（探针）中与核蛋白有结合能力的序列，用冷探针竞争实验验证其结合的特异性，超级凝胶滞留实验验证与探针结合的核蛋白种类；提取腹主动脉缩窄后1月、3月和对照组大鼠的心肌组织核蛋白，重复上述实验过程。通过上述两个实验步骤，筛选TNF-α基因5’上游核酸序列中可能的启动子位点。4．培养原代心肌细胞和第2代心脏成纤维细胞，分别加入含1mg／ml、0.5mg／ml、0.1mg／ml、0.05mg／ml、0.01mg／ml 814的DMEM培养基（814溶于乙醇后梯度稀释），用含相对应浓度乙醇的DMEM培养基孵育细胞作为对照。24小时后用传代细胞消化液消化成单细胞悬液，0.4％台盼兰染色，计算死亡细胞百分比。将心肌细胞和第2代成纤维细胞接种在细胞爬片上，用含0.1mg／ml 814的DMEM或含乙醇的DMEM孵育心肌细胞和成纤维细胞24小时，用免疫组化染色测定TNF-α合成。结果：1．手术组动物18只，术后死亡5只，最终获得完整实验指标测定的大鼠共13只，腹主动脉缩窄1个月大鼠7只，腹主动脉缩窄3个月大鼠6只。对照12只（6只为1个月对照，6只为3个月对照）。主动脉环缩术前鼠尾动脉血压119.8±13.5mmHg，假手术组鼠尾动脉血压110.4±17.6mmHg，差异没有显著性，P＞0.05。腹主动脉环缩术后1周鼠尾动脉压测不到，表明模型建立成功。超声心动图、大体标本病理分析室壁厚度和心肌细胞横截面积结果显示：腹主动脉环缩3个月大鼠与假手术组大鼠相比，左心室出现明显肥厚，差异具有显著性；手术后1个月大鼠与假手术组大鼠相比差异没有显著性。假手术组大鼠心肌TNF-α免疫组化染色阴性，手术后1月、3月大鼠心肌免疫组化染色均呈强阳性。2．TNF-α的免疫组化染色在对照心肌细胞呈阴性，100ng／ml脂多糖、10^-5MNE、10^-7M AngⅡ孵育心肌细胞24小时、48小时后，心肌细胞胞浆中出现棕色颗粒，表明心肌细胞中TNF-α合成，且随着作用时间的延长这种颗粒的颜色深度和密度有增强趋势。与对照心肌细胞相比，10^-5M NE、10^-7AngⅡ孵育心肌细胞24小时导致心肌细胞TNF-α的mRNA显著增高，孵育48小时有进一步的升高。3．EMSA：对照组心肌细胞核蛋白与TNF-α上游两段序列[-619～-591和-508～-481]有很弱的结合，10^-5M NE和10^-7M AngⅡ孵育的心肌细胞核蛋白与之结合均显著增强，p65（NF-κB的亚单位）单克隆抗体竞争核蛋白与寡核苷酸的结合，表明NE和AngⅡ激活心肌细胞的NF-κB，向细胞核内转移，与之结合的寡核苷酸序列中NF-κB的结合位点可能是TNF-α表达的启动子位点。假手术组大鼠心肌核蛋白也与上述两段寡核苷酸序列的结合也很弱，后负荷增加后心肌的核蛋白与之结合显著增强，p65单克隆抗体竞争之消失。上述两步实验结果都通过冷探针竞争实验证明了结合的特异性。4．814孵育的心肌细胞的死亡率随814浓度增加而增加，含1mg／ml、0.5mg／ml、0.1mg／ml、0.05mg／ml、0.01mg／ml 814的DMEM培养基孵育的心肌细胞死亡率均数分别是94.5％，74.0％，54.9％，37.6％，21.6％，剔除了溶剂的细胞毒性后814对培养心肌细胞仍有剂量依赖性毒性作用。814对培养心脏成纤维细胞的影响与之相似，含1mg／ml、0.5mg／ml、0.1mg／ml、0.05mg／ml、.01mg／ml 814的DMEM培养基孵育的成纤维细胞死亡率均值分别是78.1％，56.4％，40.6％，25.4％，15.9％。剔除了溶剂的细胞毒性后814对培养心肌细胞仍有剂量依赖性毒性作用。用含0.1mg／ml 814的DMEM孵育心肌细胞和成纤维细胞24小时，免疫组化染色示TNF-α阳性，在胞浆内有棕色颗粒散在分布，对照细胞免疫组化染色呈阴性，提示中药814促进培养的心肌细胞和心脏成纤维细胞合成TNF-α，并对培养心肌细胞和心脏成纤维细胞有毒性作用，细胞死亡率随814浓度增高而升高。结论：环缩腹主动脉，左室后负荷增加，在心肌肥厚形态学改变出现之前，即可促进心肌细胞表达TNF-α，并在肥厚心肌中持续存在。通过观察体外培养的心肌细胞，证明10^-5M NE和10^-7M AngⅡ均可促进培养心肌细胞表达TNF-α。在TNF-α表达增高的大鼠心肌和离体培养的心肌细胞，核蛋白与TNF-α基因5’上游具有NF-κB结合能力的核酸序列结合增强，表明NF-κB是激活TNF-α表达的共同通路。TNF-α5’上游的两段序列（-619～-591和-508～-481）可能在其表达调控中起一定作用。中药814促进培养的心肌细胞和心脏成纤维细胞合成TNF-α，并对培养心肌细胞和心脏成纤维细胞有毒性作用，细胞死亡率随814浓度增高而增大。