研究背景脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,N.m)是流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)的病原菌,引起人脑膜炎和败血症,人类是其唯一易感宿主。N.m在全球范围内引起流脑暴发和流行,不同地区报告的血清群存在差异,我国历史上流脑流行以A群为主。二十世纪80年代以前,我国曾出现过五次A群流脑大流行,最严重的一次发生在1967年,发病率达403/10万。从二十世纪八十年代开始,随着A群流脑疫苗的广泛接种,流脑疫情得以控制,至九十年代,发病率下降至1/10万,2000年以后下降至0.2/10万。2003年起,安徽省曾发生多起C群流脑暴发,随后多个省份也陆续报告C群流脑病例,我国流脑的血清群构成比例发生了明显变化。2003-2012年的十年间,我国A群流脑所占比例明显下降,C群则显著增加,2005年起,我国开展A+C群流脑疫苗接种,流脑发病率逐年下降,至2010年已降至0.02/10万。N.m流行病学研究有助于了解细菌的传播,并确定毒力明显增强的特异克隆群,目前的研究方法中,多位点序列分型(MLST)被认为是全球N.m基因分型的金标准。对流脑患者体内分离菌株的MLST结果显示,我国N.m存在多个克隆系,A群N.m(NmA).主要为ST-5 complex, B群N.m(NmB)主要为ST-4821complex和ST-5562 subgroup, C群N.m (NmC)主要为ST-4821 complex, W群N.m (NmW)主要为ST-11 complex。其中,A群ST-5complex中的ST-7型及W群的ST-11型在全球范围内存在,而其余三种克隆系目前仅存在于我国,尤其是C群ST-4821 complex,为我国近十年主要流行的N.m。在我国分离的NmC中,80%以上为ST-4821 complex,这其中ST-4821占90%,可见,使用MLST方法并不能很好地找出我国ST-4821 NmC之间的差异。血清群及ST分型结果使得这些菌株看似来自同一克隆,实际上则不然,基于大量全基因组测序资料显示,没有完全相同的两株细菌。如果使用全基因组测序比较我国ST-4821NmC之间的差异,工作量大,耗时长,且不适用于对大量细菌的研究。因此,需要一种分辨能力强且简便易行的方法。多位点可变数目串联重复序列分析(简称MLVA),利用细菌中DNA串联重复序列的自然变异,对细菌进行分子分型,既能区分不同克隆群的菌株,又能找出相同血清群相同克隆群菌株之间的差异。因其分辨能力强、操作简单等优势,MLVA已广泛用于多种细菌的分子分型、流行病学调查及溯源等研究中。也有研究者将MLVA用于N.m的研究中,然而,他们在搜索可变数目串联重复序列(VNTR)位点时,参考的菌株局限于欧美地区,并未考虑我国的N.m,不能保证这些位点完全适合我国菌株。因此,需要结合我国N.m自身特点,对这些位点进行筛选,建立适合我国N.m的MLVA方法,并初步建立我国N.m的MLVA数据库。从不同研究角度出发,对数据库中菌株的MLVA结果进行分析,详细挖掘VNTR位点分布特征,再基于聚类分析结果,观察我国N.m的克隆群分布,并研究我国流脑主要流行群C群的微进化。同时,用MLVA对流脑暴发调查时采集的菌株进行分析,探讨将其用于快速判断N.m暴发相关菌株的可行性。研究目的1、筛选适合中国N.m的VNTR位点,建立我国N.m的MLVA方法。2、初步建立我国N.mMLVA数据库,并完善MLST数据库。3、对我国N.m进行MLVA分型,结合菌株现有的病原学及流行病学特征,建立不同MLVA分析方案,比较其优势及局限性,明确其应用范围及价值。4、分析中国C群,特别是ST-4821 complex N.m的系统发育特点及微进化特征。5、评价MLVA在N.m暴发调查中的应用,建立快速确定暴发相关菌株的方案。研究方法1、菌株选择。根据我国N.m数据库中保存的菌株数量、三间分布及微生物学特征,通过定额抽样、按比例分层抽样及偶遇抽样等方法选取菌株用于MLVA实验。用于确定VNTR位点的实验菌株选择时,尽量选择各种特征不同的菌株。选择方法采用定额抽样,依次按血清群、ST型及PFGE型对N.m数据库中的菌株进行分层,每种细菌选择1株。用于建立MLVA数据库的菌株选择时,根据课题设计,初步确定选择200株N.m,采用按比例分层抽样方法,首先按年份对菌株分层,确定每年份选择菌株数量,其次按照血清群、ST型、来源省份及来源人群比例依次分层抽样。上述条件均相同时,采用偶遇抽样方法,使用实验室正在培养或已保存DNA的菌株。实验中增加菌株时,根据研究目的分别采用定额抽样和按比例分层抽样。2、位点选择。通过查阅文献获取用于N.m的VNTR位点,首先剔除报道中显示为如下结果的位点：“多条带”、“非所有菌株共有”、“多拷贝”、“单一条带”及“侧翼区现多态性”。将初步筛选后保留的位点用于我国N.m的MLVA预实验,分析PCR产物电泳条带,按照“所有菌株中均可检出”,且“多态性高”、“条带单一”和“侧翼区稳定”等原则筛选合适的VNTR位点。3、MLVA实验。提取菌株DNA,使用VNTR位点对应的带有荧光标记的引物进行PCR扩增；根据PCR产物确定STR内标,使用全自动测序仪进行STR检测；电泳图谱即fsa文件经GeneMapper软件处理,生成PDF图谱及Excel文件,获得PCR产物片段大小；根据相应位点重复序列及其侧翼片段大小,计算样本中该位点的重复数,将计算好的重复数以整数录入MLVA数据库。如果出现0.5个拷贝,则通过测序判定实际重复数,并在以后的试验中遵循此标准。将每个菌株的对应VNTR位点重复数提交到生物信息工具网站,计算各个VNTR位点在研究菌株中的改良Simpson差异性指数,对位点的分辨力进行评价,根据各个VNTR位点的分辨力设计不同的位点组合方案,将MLVA数据自Excel导入BioNumerics软件,采用非加权组平均数法(UPGMA)进行分析,获取菌株的MLVA基因型及克隆群分布聚类图。4、MLST实验。通过MLST方法确定ST型及ST complex。采用N.m的7个管家基因进行检测,其结果经测序后提交到MLST数据库网站,获得各个基因对应结果,再将7个基因对应结果提交到数据库中获得相应的ST型及ST complex。将结果录入我国N.m的MLST数据库,并导入BioNumerics软件,分析ST型分布特点。5、根据分型数量,比较MLVA与MLST方法的分辨能力；根据聚类分析结果,判断MLVA与MLST是否存在相似趋势,分析我国NmC系统发育及微进化特征。研究结果1、自我国N.m细菌库中筛选了52株细菌用于确定VNTR位点的MLVA预试验,这些菌株来自22个省(自治区或直辖市)的病人、密切接触者及健康携带者。最终使用430株N.m建立MLVA数据库,包括1977-1996年期间分离的16株A群和12株B群,以及2003-2014年间分离的含有8种血清群的402株N.m,其中含有山东省2010年流脑暴发调查时采集的49株细菌及2014年流脑暴发调查时采集的43株细菌。2、共收集三篇文献中报道的56个VNTR位点。经过初筛,保留了19个不同的VNTR位点用于52株N.m的MLVA预试验。结果有3个位点被剔除,其中2个位点在多个菌株中未检出,1个位点需要测序方能判断PCR产物大小。最后保留16个VNTR位点(VNTR1-19,无VNTR10、16和17)用于我国N.m的MLVA研究。3、使用上述16个VNTR位点对430株N.m进行MLVA实验,共获得6880个数据,将结果录入Excel表格,初步建立了我国N.m的MLVA数据库。同时对缺少ST型信息的122株N.m进行MLST实验,增加了854个数据,完善了我国N.m的MLST数据库。4、对215株NmC的MLST和MLVA结果进行聚类分析,共分得29个ST型。而MLVA分型结果却由于采用不同的VNTR位点而表现不完全一致。使用16个VNTR位点进行分析时,215株NmC共分为201个MLVA型,182株ST-4821 complex NmC共分为176个MLVA型,118株ST-4821 NmC共分为112个MLVA型。其中6个VNTR位点(VNTR1、2、4、5、18和19)的Nei’s指数高于0.5,被称作高变位点,其余10个VNTR位点被称作稳定位点。使用上述6个高变位点中的5个位点(无VNTR5)进行MLVA的分型结果与使用16个位点的一致。采用10个稳定位点(VNTR3, VNTR6-15,无VNTR10)进行分析时,215株NmC分为55个MLVA基因型,182株ST-4821 complex NmC分为32个基因型,118株ST-4821 NmC共分为11个基因型。采用这10个稳定位点进行MLVA时,NmC系统发育特征与MLST结果存在相似趋势。5、使用5个稳定位点(VNTR7、9、12、4和15)建立的MLVA方案,对来自山东及安徽的两起暴发调查中的56株N.m进行分析,BioNumerics聚类分析结果显示,同一次流脑暴发中的暴发相关菌株聚成一簇,且与不相关菌株分开。同时,也有部分散发菌株也与暴发相关菌株聚成一簇。结论1、N.m的MLVA方案应结合菌株流行病学信息确定VNTR位点,不同国家分离的菌株使用的位点不尽相同。2、MLVA方法适合我国N.m的基因多态性及系统发育特征分析,进行MLVA实验时,需要根据不同研究目的选择合适的VNTR位点组合。研究菌株中VNTR位点多态性及菌株差异时,使用5个高变位点组合的方案；研究菌株系统发育特点及菌株之间相似性时,使用10个稳定位点组合的方案。3、MLVA方法分辨能力强于MLST方法,可以采用5个高变位点(VNTR1、2、4、18和19)分析我国NmC的基因多态性。本研究检测的215株N.m,存在29个ST型和201个MLVA型。4、MLST结果显示,我国NmC存在多种克隆群,其中最主要的为ST-4821complex,该克隆群经过近十年传播,微进化特征显示细菌的VNTR位点存在基因多态性,但MLST7个管家基因的聚类结果和MLVA中使用的10个稳定VNTR位点的聚类结果,在这些菌株之间存在相似性。5、采用5个稳定VNTR位点组合进行MLVA,可以用于ST-4821 NmC引起的同一次流脑暴发调查中,快速初筛暴发相关菌株。创新和意义1、建立了我国N.m的MLVA实验方法,初步建立了MLVA数据库。数据库中菌株覆盖年代、地区及人群广泛,包含了1977-2014年间23个年份、来自我国27个省(自治区或直辖市)的病人、密切接触者和健康人群的N.m；菌株类别详尽,包括8个血清群、111个ST型和114个PFGE型。流学病学调查中,如果分离到了N.m,或是仅仅采集到患者的咽拭子等标本时,可以提取DNA进行MLVA实验,不会因为没有获得菌株而缺少病原学信息。将新获得标本的MLVA结果提交到数据库中比对,判断其是否为新出现的类型。如果为数据库已有的MLVA型,可以比较新分离菌株与数据库中菌株的流行病学背景信息,进一步分析其可能的传播途径；如果为新的MLVA型,可以完善数据库,同时根据菌株各个VNTR位点的重复数,观察相同血清群或克隆群菌株之间的相同位点及差异位点,分析特定血清群或克隆群菌株VNTR位点多态性,寻找其微进化规律。2、首次使用MLVA方法分析我国流NmC微进化特征,证明了我国特有的ST-4821 NmC并非同一克隆,菌株之间VNTR位点多态性明显。提出可根据研究目的,选择不同VNTR位点组合方案用于N.m的MLVA研究。ST-4821 NmC自出现之日起,几乎每年都从病人或健康携带者体内分离到该菌,虽然血清群、ST型等实验结果相同,但是这些菌株的VNTR位点重复数并不是完全一致,对这些菌株的微进化特征进行研究,能够发现与表型相关的关键遗传改变,为寻找N.m在致病能力、耐药性等方面的变异源头以及其适应环境的基础提供依据。本研究中采用16个VNTR位点进行MLVA实验,基于不同研究目的选择不同位点组合进行分析,既能够了解ST-4821 NmC之间的共性,又能够发现它们之间存在的差异,尤其适合为了解决不同问题而进行的流行病学调查研究,可以同时分析这类菌株在传播、流行及致病过程中发生的有利遗传和不利变异。3、首次将MLVA方法用于我国流脑暴发中暴发相关菌株的快速初筛,并分析了使用5个稳定VNTR位点进行MLVA实验在判断暴发相关菌株中应用的可行性及局限性。当暴发流脑疫情时,临床医生及流行病学工作者会第一时间采集病人及其密切接触者的标本,但样本的分离培养成功率并不高。因此,可以在细菌培养的同时,将采集到的标本快速提取DNA,采用5个VNTR位点进行PCR扩增。对MLVA实验结果进行聚类分析,判断暴发相关菌株。当相同MLVA型N.m大量出现时,应引起高度重视,结合流行病学背景信息进一步分析,预测其传播及引起流行的趋势,并积极采取防控措施：当卫生资源有限时,可以优先对携带暴发相关菌株者进行防治。