论文部分内容阅读
实验目的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)显著改善了人表皮生长因子受体2阳性(HER2+)晚期乳腺癌患者的预后,但是耐药的发生几乎无可避免。关于TKI耐药机制的研究已成为目前乳腺癌临床诊疗的巨大挑战之一。本研究旨在通过分析临床数据发现可能与TKI耐药相关的突变,并在体外实验中验证这些突变是否与耐药相关,同时探索一种简便快捷验证点突变耐药的新方法。实验方法通过对连续TKI治疗患者多阶段循环肿瘤DNA (ctDNA)进行高通量全外显子组测序联合生物信息分析,来监测药物压力下的肿瘤突变谱变化,筛选耐药相关突变；利用CCLE数据库联合蛋白免疫印迹(western blot)、定量PCR技术选择细胞系进行下一步点突变耐药能力分析；利用CRISPR/cas9基因编辑技术构建携带靶基因点突变的稳定细胞系,利用MTS实验分析多组细胞系的多药耐药程度；利用本研究探索的本底细胞有限稀释方案进行药物选择后,通过定量PCR实验检测药物压力对突变克隆丰度的影响。实验结果通过临床数据分析,选定PIK3CA c.[3140A>G]和 ERBB2c.[2264T>C]纳入后续研究；通过细胞系状态采集,选择BT474乳腺癌细胞作为后续实验细胞系；通过CRISPR/cas9技术,获得了稳定突变的细胞群；通过MTS实验进行ICso测定,发现突变细胞对拉帕替尼和来那替尼敏感性均较原始细胞显著降低；经抗性筛选、本底细胞有限稀释后,分为基线组、拉帕替尼组、来那替尼组以及不加药组,加药(或不加药)处理3天后通过实时荧光定量PCR检测用药前后突变基因相对水平,发现不加药组突变基因相对水平均比基线组高,而拉帕替尼组和来那替尼组突变基因相对水平均比不加药组高,ERBB2c.[2264T>C]突变基因相对水平是拉帕替尼组高于来那替尼组,而PIK3CAc.[3140A>G]则反之。结论 循环肿瘤DNA检测可以发现与耐药相关的突变；ERBB2 c.[2264T>C]点突变和PIK3CAc.[3140A>G]点突变可以提高HER2+乳腺癌细胞生长速度,并且均与拉帕替尼和来那替尼的耐药相关,ERBB2 c.[2264T>C]点突变对拉帕替尼的耐药程度比来那替尼更高,而PIK3CA c.[3140A>G]反之；ctDNA检测分析、CRISPR/cas9基因编辑、本底细胞有限稀释、实时荧光定量PCR检测策略有望成为未来体外实验中高通量筛选耐药点突变的简便快捷的新方法。