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结核病是由结核分枝杆菌(Tuberculosis, TB)感染引起的一种慢性消耗性人兽共患病,全世界约有20亿人感染该病,其中10%有可能发展为活动性肺结核。结核分枝杆菌的致病机理十分复杂,尤其是近年来耐药和耐多药结核菌的出现,给临床治疗结核病带来很大的困难,特别是和其他疾病混合感染(如HIV)增加了患者的死亡率。虽然卡介苗目前是预防结核病的唯一手段,但卡介苗的保护率很低,而且仅对儿童和未成年人有效,对成年人几乎没有保护作用。因此,寻求新的有效途径来防治结核病显得尤为重要。近年来发现,肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)作为肺脏的“物理屏障”,同肺泡巨噬细胞一起在机体对抗Mtb感染中发挥着重要的免疫调控功能。而miRNA是作为一种内源性具有调控功能的非编码RNA,在机体的发育、生理和病理发生过程中有着重要的调控功能。miRNA可以影响宿主抵抗Mtb的感染过程,其异常表达也与结核病的发生密切相关。众所周知,Toll样受体(Toll-like receptors.TLRs)作为先天免疫中的模式识别受体(PRR),是连接先天免疫和获得性免疫的“桥梁”,能够监视与识别各种不同的病原相关分子模式(PAMP),是机体抵抗病原菌(如Mtb)感染的“第一道屏障”。因此,为了揭示niRNA在肺脏AECⅡ细胞抗Mtb感染中与TLRs信号通路间的相互调控作用,本研究以AECⅡ细胞为细胞模型,建立结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv和减毒株BCG细胞-细菌互作模型,在前期测定miRNA差异表达谱的基础上,分析了Mtb感染前后AECⅡ细胞中TLRs信号通路的变化,以及niR-29a, miR-146a和miR-200c的表达情况,并进一步分析了在AECⅡ细胞中过表达miR-146a对TLRs信号通路的影响,获得了一下结果：(1)利用H37Rv和BCG分别感染AECⅡ细胞株A549,分析在感染6h,12 h和24 h时,检测TLRs信号通路、促炎细胞因子与miR-29a、miR-146a和miR-200c的表达变化。试验结果表明,A549细胞中TLR2/4、NFκB、MyD88的mRNA和蛋白表达水平在感染6h时显著升高,且H37Rv感染组高于BCG感染组；而促炎细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8和IL-12 α的mRNA表达水平随着感染时间升高,且H37Rv感染组TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-8的表达显著高于BCG感染组,IL-12a差异不显著,而在H37感然组中IL-6在24h显著下降。miR-146a随着感染时间表达显著升高,且H37Rv高于BCG; miR-29a在感染6h时表达量H37Rv显著高于BCG,但在12h和24h时,BCG感染组miR-29a表达量较6h时显著升高,而H37Rv感染组miR-29a表达量显著下调,但这两个感染组12h与24h时间点的组内差异不显著；miR-200c在BCG感染组在3个时间点先降低后升高,表现为感染后表达抑制,而在H37Rv感染组内表达差异不显著,且表达量低于BCG感染组6h和24h的相应时间点。这为进一步分析在Mtb感染肺脏上皮Ⅱ型细胞中niR-146a与TLRs信号通路的免疫应答机制奠定了基础。(2)基于miR-146a作为TLRs信号通路的负调控因子,其表达量在Mtb感染AECⅡ细胞中呈上调趋势的试验结果,本实验构建并包装过表达niR-146a腺病毒载体,并分析了A549细胞中过表达miR-146a时在Mtb感染中,miR-146a对TLRs信号通路及细胞因子的表达调控作用,该试验结果表明,构建的过表达miR-146a腺病毒载体能够在293T细胞和A549细胞中过表达miR-146a;当过表达miR-146a时,在BCG感染组中TLR2的表达表现为感染后显著抑制,而H37Rv感染组中TLR2表达差异不显著；TLR4在BCG和H37Rv感染组中均表现为显著下调,这有可能是在AEC Ⅱ细胞中,TLR.2是以同源二聚体形式识别BCG,以TLR2/TLR4异源二聚体形式识别H37Rv。过表达miR-146a时,在BCG和H37Rv感染组中对TLR信号通路的下游分子MyD88、TRAF6、NF-κB和促炎细胞因子TNF-α、EL-6的表达均表现为感染后的抑制作用,而IL-8表达影响不明显。综上所述,在AECⅡ细胞抗Mtb感染的过程中,H37Rv对TLRs信号通路的活化和引起的炎性反应强于BCG,且miR-146a负调控TLRs信号通路中MyD88、TRAF、NF-κB和炎症因子IL-6等来参与调控AECⅡ细胞对Mtb的感染过程,这为进一步研究miRNA在AECⅡ细胞感染Mtb中的免疫调控作用丰富了材料。