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H2S是一种重要的气体信号分子，在动物，包括人体中发挥着重要的生理功能。H2S在真核生物中的作用研究比较多，而在微生物中发挥的功能研究相对较少。迄今为止，关于H2S在细菌中发挥的信号调控功能研究多与硫代谢相关，如调控因子CstR，FisR以及SqrR。但是在细菌中H2S是否参与其它生理功能的调控还有待探究。
目前关于H2S与硫烷硫信号分子存在争议，越来越多的证据指明H2S是以硫烷硫的形式参与重要的信号传递功能。硫烷硫在胞内普遍存在，它可以通过H2S的硫氧化途径，或者利用半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸的代谢途径产生等。根据课题组已发表的文章报道，胞内的硫烷硫水平在不同的生长阶段不同，这暗示着硫烷硫可能参与了细胞重要的信号调控。硫烷硫化学性质比较活泼，既具有亲核性也具有亲电性，它通常能够对蛋白上的活性半胱氨酸巯基进行修饰，影响蛋白的活性从而发挥信号传递功能。
课题组之前以条件致病菌P.aeruginosaPAO1为研究对象，发现H2S参与了PAO1重要的生理调控。结果显示H2S合成基因cbs、cse、mst以及cysI的缺失使得PAO1毒力因子的产生和致病性受到显著影响，而H2S代谢基因sqr和pdo的缺失对其表型几乎无影响。但关于H2S是以何种机制参与了PAO1致病性的调控，且是否还影响了PAO1其它的生理功能，这些都有待研究。
本文以P.aeruginosaPAO1为研究对象，探究了H2S/硫烷硫在PAO1致病性及耐药性方面发挥作用的机制，以及对色素生成的影响。主要研究内容如下:
1.硫烷硫信号分子通过调控LasR的活性影响P.aeruginosaPAO1的群体感应与毒力
在构建成功的H2S合成基因和代谢基因分别缺失的菌株基础上，分别测定PAO1，Pa△H2S，Pa3K和Pa7K胞内的硫烷硫水平，发现与野生型PAO1相比，Pa3K菌株的硫烷硫水平没有明显变化，而Pa△H2S和Pa7K菌株的硫烷硫水平明显降低。硫烷硫的水平和测得的与致病性相关的表型比较一致，即硫烷硫水平较低的菌株其毒力因子的产生量和致病能力也大大降低。结合转录组数据，发现Pa△H2S菌株相比于PAO1有大量的基因的转录水平都出现的明显的改变，其中与群体感应相关的许多调控蛋白和关键基因的表达出现了下调，包括lasR。LasR蛋白是群体感应系统中关键调控因子，它的缺失会使得群体感应系统几近崩溃。LasR缺失的表型结果和Pa△H2S比较类似，因此推测硫烷硫通过影响LasR的活性进而调控了PAO1的毒力和致病性。
为验证上述猜测，通过在大肠杆菌BL21中构建mKate荧光蛋白报告系统，发现硫烷硫而非H2S能够激活LasR，且通过在报告质粒上构建LasR半胱氨酸的突变体蛋白，发现LasR蛋白的DNA分子结合结构域(DBD)的三个半胱氨酸对于其活性十分关键。质谱结果发现，这三个半胱氨酸都能够被硫烷硫修饰，其修饰类型主要是形成了过硫化物(Cys188-SSH)，三硫化物(Cys188-SSSH)以及五硫键的硫桥(Cys201-S-SSS-S-Cys203)形式。EMSA实验结果显示硫烷硫处理并不会影响LasR与目的DNA的亲和性。体外翻译实验证实硫烷硫对LasR具有直接激活作用，我们推测硫烷硫激活LasR可能会促进招募更多的RNA聚合酶激活下游基因的转录。
利用RT-qPCR技术测定不同生长时期受LasR调控的下游基因的转录水平，发现其转录量与硫烷硫的水平息息相关。LasR的活性受群体感应信号分子3O-C12-HSL和硫烷硫的双调控。当硫烷硫浓度低时，即使在高浓度的3O-C12-HSL的条件下也不足以激活LasR。因此，硫烷硫信号分子对于群体感应LasR的自诱导存在“制动”作用，尤其是在生长后期。H2S以硫烷硫形式通过激活LasR参与PAO1群体感应和毒力的调控，这一发现对于细菌的防治感染具有一定的指导意义。
2.硫烷硫信号分子通过失活MexR调控P.aeruginosaPAO1的耐药性
MexAB-OprM外排泵的过表达是引起PAO1多重耐药的重要因素之一。在分析转录组数据时发现，Pa△H2S中mexAB-oprM操纵子的转录水平发生了明显的下调，而其转录抑制蛋白基因mexR并无明显变化。利用RT-qPCR进一步验证了硫烷硫水平较低的Pa△H2S菌株中mexA表达水平也较低。我们选取了五种MexAB-OprM的作用药物探究硫烷硫水平与耐药性之间的联系。结果发现额外添加H2S能够显著提高PAO1的耐药性。由于PAO1中的SQR能将外源或内源产生的H2S氧化成硫烷硫，因此初步得出结论硫烷硫参与了外排泵MexAB-OprM的表达调控。体内体外数据均证实硫烷硫而非H2S能够通过直接失活MexR，解除对下游外排泵基因的转录抑制。进一步地，我们确定了MexR的Cys30和Cys62是其感应硫烷硫的关键活性位点，两者缺一不可。结合非还原SDS/PAGE和质谱数据，确定了硫烷硫对MexR存在部分修饰，主要是在两个单体的Cys30和Cys62之间形成二硫键和少量的三硫键形式，其构象的改变使得与DNA的亲和力降低，外排泵基因得以表达，耐药性增强。为验证硫烷硫是否可以作用于同一MarR家族中其它转录因子，我们以典型的E.coliMG1655中MarR为研究对象进行了验证。体内体外实验皆证实MarR也能够感应硫烷硫。因此推测硫烷硫可能是一个普遍的信号分子作用于MarR家族蛋白，从而发挥生理功能。
针对以上结果，提出了MexR转录抑制蛋白感应胞内硫烷硫水平变化的动态模型，该模型的核心机制为:mexR和mexAB-oprM共用相同的启动子区域，都能够被MexR蛋白抑制转录。当处于对数生长期，胞内低水平的硫烷硫不足以失活MexR，外排泵系统无法表达;当处于稳定期时，胞内足够高的硫烷硫水平能够失活MexR，开启外排泵的表达。
3.硫烷硫信号分子通过OspR影响P.aeruginosaPAO1色素的生成
OspR作为一个氧化压力应激和调控色素产生的转录调控蛋白，它的缺失会导致PAO1对H2O2的敏感性增强。通过构建ospR缺失菌株以及回补菌株进行表型的测定，发现OspR的过表达会导致黑红色色素的产生，且耐药能力也明显增强。额外添加H2S会导致黑红色素产生量减少。OspR是一转录抑制蛋白，它能够抑制下游诸多基因的转录，如PA2826，PA2009，PA1897等。RT-qPCR数据显示H2Sn可以诱导OspR调控的这些基因的转录。通过体外EMSA实验，发现与硫烷硫反应后的OspR降低了与DNA的亲和性，且这种作用主要是与Cys24和Cys134有关。本部分只在表型水平上进行了测定，其硫烷硫通过OspR具体参与色素产生和耐药性的机制还有待研究。
综上，本论文对硫烷硫在条件致病菌P.aeruginosaPAO1中的生理功能进行了探究，对其在致病性和耐药性两方面的信号转导途径进行了揭示。此发现丰富了人们对硫烷硫在细菌中参与除硫氧化代谢之外的信号功能研究的认识。
目前关于H2S与硫烷硫信号分子存在争议，越来越多的证据指明H2S是以硫烷硫的形式参与重要的信号传递功能。硫烷硫在胞内普遍存在，它可以通过H2S的硫氧化途径，或者利用半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸的代谢途径产生等。根据课题组已发表的文章报道，胞内的硫烷硫水平在不同的生长阶段不同，这暗示着硫烷硫可能参与了细胞重要的信号调控。硫烷硫化学性质比较活泼，既具有亲核性也具有亲电性，它通常能够对蛋白上的活性半胱氨酸巯基进行修饰，影响蛋白的活性从而发挥信号传递功能。
课题组之前以条件致病菌P.aeruginosaPAO1为研究对象，发现H2S参与了PAO1重要的生理调控。结果显示H2S合成基因cbs、cse、mst以及cysI的缺失使得PAO1毒力因子的产生和致病性受到显著影响，而H2S代谢基因sqr和pdo的缺失对其表型几乎无影响。但关于H2S是以何种机制参与了PAO1致病性的调控，且是否还影响了PAO1其它的生理功能，这些都有待研究。
本文以P.aeruginosaPAO1为研究对象，探究了H2S/硫烷硫在PAO1致病性及耐药性方面发挥作用的机制，以及对色素生成的影响。主要研究内容如下:
1.硫烷硫信号分子通过调控LasR的活性影响P.aeruginosaPAO1的群体感应与毒力
在构建成功的H2S合成基因和代谢基因分别缺失的菌株基础上，分别测定PAO1，Pa△H2S，Pa3K和Pa7K胞内的硫烷硫水平，发现与野生型PAO1相比，Pa3K菌株的硫烷硫水平没有明显变化，而Pa△H2S和Pa7K菌株的硫烷硫水平明显降低。硫烷硫的水平和测得的与致病性相关的表型比较一致，即硫烷硫水平较低的菌株其毒力因子的产生量和致病能力也大大降低。结合转录组数据，发现Pa△H2S菌株相比于PAO1有大量的基因的转录水平都出现的明显的改变，其中与群体感应相关的许多调控蛋白和关键基因的表达出现了下调，包括lasR。LasR蛋白是群体感应系统中关键调控因子，它的缺失会使得群体感应系统几近崩溃。LasR缺失的表型结果和Pa△H2S比较类似，因此推测硫烷硫通过影响LasR的活性进而调控了PAO1的毒力和致病性。
为验证上述猜测，通过在大肠杆菌BL21中构建mKate荧光蛋白报告系统，发现硫烷硫而非H2S能够激活LasR，且通过在报告质粒上构建LasR半胱氨酸的突变体蛋白，发现LasR蛋白的DNA分子结合结构域(DBD)的三个半胱氨酸对于其活性十分关键。质谱结果发现，这三个半胱氨酸都能够被硫烷硫修饰，其修饰类型主要是形成了过硫化物(Cys188-SSH)，三硫化物(Cys188-SSSH)以及五硫键的硫桥(Cys201-S-SSS-S-Cys203)形式。EMSA实验结果显示硫烷硫处理并不会影响LasR与目的DNA的亲和性。体外翻译实验证实硫烷硫对LasR具有直接激活作用，我们推测硫烷硫激活LasR可能会促进招募更多的RNA聚合酶激活下游基因的转录。
利用RT-qPCR技术测定不同生长时期受LasR调控的下游基因的转录水平，发现其转录量与硫烷硫的水平息息相关。LasR的活性受群体感应信号分子3O-C12-HSL和硫烷硫的双调控。当硫烷硫浓度低时，即使在高浓度的3O-C12-HSL的条件下也不足以激活LasR。因此，硫烷硫信号分子对于群体感应LasR的自诱导存在“制动”作用，尤其是在生长后期。H2S以硫烷硫形式通过激活LasR参与PAO1群体感应和毒力的调控，这一发现对于细菌的防治感染具有一定的指导意义。
2.硫烷硫信号分子通过失活MexR调控P.aeruginosaPAO1的耐药性
MexAB-OprM外排泵的过表达是引起PAO1多重耐药的重要因素之一。在分析转录组数据时发现，Pa△H2S中mexAB-oprM操纵子的转录水平发生了明显的下调，而其转录抑制蛋白基因mexR并无明显变化。利用RT-qPCR进一步验证了硫烷硫水平较低的Pa△H2S菌株中mexA表达水平也较低。我们选取了五种MexAB-OprM的作用药物探究硫烷硫水平与耐药性之间的联系。结果发现额外添加H2S能够显著提高PAO1的耐药性。由于PAO1中的SQR能将外源或内源产生的H2S氧化成硫烷硫，因此初步得出结论硫烷硫参与了外排泵MexAB-OprM的表达调控。体内体外数据均证实硫烷硫而非H2S能够通过直接失活MexR，解除对下游外排泵基因的转录抑制。进一步地，我们确定了MexR的Cys30和Cys62是其感应硫烷硫的关键活性位点，两者缺一不可。结合非还原SDS/PAGE和质谱数据，确定了硫烷硫对MexR存在部分修饰，主要是在两个单体的Cys30和Cys62之间形成二硫键和少量的三硫键形式，其构象的改变使得与DNA的亲和力降低，外排泵基因得以表达，耐药性增强。为验证硫烷硫是否可以作用于同一MarR家族中其它转录因子，我们以典型的E.coliMG1655中MarR为研究对象进行了验证。体内体外实验皆证实MarR也能够感应硫烷硫。因此推测硫烷硫可能是一个普遍的信号分子作用于MarR家族蛋白，从而发挥生理功能。
针对以上结果，提出了MexR转录抑制蛋白感应胞内硫烷硫水平变化的动态模型，该模型的核心机制为:mexR和mexAB-oprM共用相同的启动子区域，都能够被MexR蛋白抑制转录。当处于对数生长期，胞内低水平的硫烷硫不足以失活MexR，外排泵系统无法表达;当处于稳定期时，胞内足够高的硫烷硫水平能够失活MexR，开启外排泵的表达。
3.硫烷硫信号分子通过OspR影响P.aeruginosaPAO1色素的生成
OspR作为一个氧化压力应激和调控色素产生的转录调控蛋白，它的缺失会导致PAO1对H2O2的敏感性增强。通过构建ospR缺失菌株以及回补菌株进行表型的测定，发现OspR的过表达会导致黑红色色素的产生，且耐药能力也明显增强。额外添加H2S会导致黑红色素产生量减少。OspR是一转录抑制蛋白，它能够抑制下游诸多基因的转录，如PA2826，PA2009，PA1897等。RT-qPCR数据显示H2Sn可以诱导OspR调控的这些基因的转录。通过体外EMSA实验，发现与硫烷硫反应后的OspR降低了与DNA的亲和性，且这种作用主要是与Cys24和Cys134有关。本部分只在表型水平上进行了测定，其硫烷硫通过OspR具体参与色素产生和耐药性的机制还有待研究。
综上，本论文对硫烷硫在条件致病菌P.aeruginosaPAO1中的生理功能进行了探究，对其在致病性和耐药性两方面的信号转导途径进行了揭示。此发现丰富了人们对硫烷硫在细菌中参与除硫氧化代谢之外的信号功能研究的认识。