鱼类在脊椎动物系统演化过程中起着承前启后的地位。因此,对鱼类性别决定与分化机制的研究,是整个脊椎动物性别决定与分化的重要组成部分。与哺乳动物、鸟类等高等脊椎动物相比,鱼类性别决定与分化机制具有原始性、易变性和多样性。它仍然以遗传基因为性别决定和分化的基础,同时也会受到某些外界环境因素的影响,故鱼类的性别决定与分化过程益显复杂。孕激素(DHP)是包括尼罗罗非鱼在类的大多数硬骨鱼的配子成熟激素,它作为一种主要的性类固醇激素,仅在配子成熟时期的体细胞中合成。主要是促进配子的最终成熟以及排精(卵)过程。通过离体和在体研究,已经证明了DHP信号通路在鳕鱼(Gadus morhua)、大西洋鲑鱼(Salmon salar)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)等鱼类的精子发生过程中发挥重要作用。但是到目前为止,DHP在硬骨鱼类雌性性别分化过程中的作用还鲜为人知。因此,本实验以尼罗罗非鱼为实验材料,通过CRISPR/Cas9技术敲除核受体pgr基因以及用孕激素受体拮抗剂RU486阻断DHP信号通路等实验,深入研究DHP对雌性性别分化过程的调控机制,最终加深我们对DHP在尼罗罗非鱼甚至硬骨鱼类早期性别分化过程中的作用认识。本论文的主要研究结果如下:(1)利用鱼类孕激素(DHP)受体的拮抗剂RU486从孵化后5天(days after hatching,dah)开始处理基因型为XX的雌性尼罗罗非鱼,分别在20、40、90、120dah取材检测。与正常的雌雄对照相比,RU486的持续处理不仅阻遏了卵子发生过程,还降低性腺中雌性通路基因的表达和血清中雌激素水平。相反,RU486处理激活了雄性通路基因的表达。这暗示:鱼类孕激素(DHP)直接或间接通过雌激素参与生殖细胞的减数分裂起始以及性别分化过程。(2)运用RU486从5dah开始处理雌性尼罗罗非鱼,分别到20、40、90dah停止处理,接着正常饲养到120dah取材检测。令人惊奇的是,此时的性腺发育成具有生理功能的精巢。我们推测性逆转的原因可能是由于体细胞的雄性化以及内源性DHP的恢复所致。(3)在用RU486阻断DHP信号通路的同时,尝试分别利用一定剂量的外源DHP/E2进行回救。额外补偿DHP不能回救RU486对性腺发育的影响。同时发现,额外补偿E2的性腺组织观察结果显示:E2能成功诱导RU486处理的雌鱼恢复卵巢分化。不过有趣的是,在用RU486阻断DHP这条信号通路时,E2不能完全的诱导雌性的发育。因为卵巢体细胞中foxl2和cyp19a1a的RNA表达水平仍然显著性低于正常雌鱼对照。我们认为:在RU486处理鱼中,外源E2诱导的卵子发生可能是直接作用于生殖细胞产生的结果,并不是通过内源性E2的产生这条途径,当然具体的机制还需要进一步的研究。总的来说,在这些数据的基础之上,我们提出“雌激素和孕激素(DHP)协同调控雌性发育”的观点。(4)利用CRISPR/Cas9技术成功在尼罗罗非鱼建立孕激素核受体pgr的纯合敲除体系。组织学检测结果发现,在性别分化早期,纯合敲除的雌雄鱼与正常对照相比,无明显差异。这暗示尼罗罗非鱼孕激素通过核体受pgr激活的通路,可能只参与配子的最终成熟或排精排卵过程。因此,我们推测尼罗罗非鱼DHP通过膜受体或尚未发现核受体pgr的异构体参与减数分裂的起始和调控并维持雌性性别分化过程。总之,我们利用RU486药物处理证实了孕激素(DHP)对尼罗罗非鱼的卵巢分化具有重要作用。同时,核受体pgr敲除实验暗示这种调控作用是膜受体或者其它类型的核受体介导的DHP信号通路,通过间接或直接作用于雌激素产生。