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第一部分CDK7抑制剂THZ1对GBM的抑制作用及机制研究研究背景:胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是成人最常见和恶性程度最高的脑肿瘤。尽管有手术、放疗和替莫唑胺化疗组成的综合治疗,中位生存率仍为12–15月,预后极差。目前分子靶向药物治疗GBM多不理想。GBM较高的异质性和可塑性被认为是影响治疗效果的主要原因。在同一GBM肿瘤内的不同细胞可有不同的基因表达特征,各种细胞亚群可携带不同的药物靶点,并表现出对治疗的不同反应。GBM细胞也可以针对化疗及其靶向治疗作出反应,迅速调节其基因组或转录,导致致癌靶点移位以及药物耐药。因此针对GBM的上述特征,迫切需要新的治疗策略。本研究通过表观调控小分子抑制剂抗GBM药效筛选发现CDK7抑制剂THZ1对GBM有较强的抑制作用,我们通过药物靶向或基因敲低的方法在体内体外验证了靶向CDK7对GBM的抑制作用,并进一步探讨了其抗GBM机制。研究目的1、通过体内体外实验验证THZ1对GBM的抑制作用2、通过基因编辑方法靶向CDK7观察对GBM的抑制作用3、探讨靶向CDK7抑制GBM的机制技术方法1、通过MTS方法对96种表观小分子抑制剂的抗GBM作用进行筛选2、通过Celltiter-Glo,Celltiter-Blue等检测细胞活性方法观察靶向CDK7对GBM的抑制作用3、通过裸鼠皮下及原位模型验证THZ1体内对GBM的抑制作用4、通过CRISPR-Cas9或RNA干扰抑制CDK7表达观察对GBM细胞生长的抑制作用5、通过Ed U方法检测THZ1对GBM细胞增殖的抑制作用6、通过Caspase-Glo方法检测THZ1对GBM细胞Caspse3/7的激活7、通过Caspase-Glo方法检测THZ1对GBM细胞毒性作用8、通过Annexin-V/DAPI方法检测THZ1对GBM细胞凋亡的诱导作用9、通过q PCR,Western Blot,RNAseq以及Ch IPseq方法深入探讨THZ1抗GBM作用机制10、临床数据库分析CDK7与胶质级别以及患者预后的关系研究结果1、表观小分子抑制剂药物库筛选发现THZ1具有较强抗GBM作用2、THZ1在体外具有较强的抗GBM作用3、THZ1在体内对GBM生长有明显抑制作用4、CRISPR-Cas9或sh RNA靶向CDK7能够明显抑制GBM细胞的生长5、THZ1能够阻滞GBM细胞周期,抑制其增殖并诱导凋亡6、THZ1诱导GBM细胞基因转录下调,尤其对超增强子相关基因下调更明显7、THZ1敏感的超增强子相关基因对GBM生长有重要作用8、CDK7表达越高,胶质瘤患者预后越差结论1、通过THZ1或基因干扰靶向CDK7能够明显抑制GBM体内体外生长2、THZ1诱导GBM细胞广泛转录下调,尤其对超增强子相关基因下调更明显3、表达活跃THZ1敏感并且与超增强子相关的基因对GBM有重要作用4、CDK7是GBM患者预后标志物第二部分Panobinostat分别与BEZ235或JQ1协同抗GBM作用及机制研究研究背景组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)介导的表观遗传学调控是胶质细胞瘤发生发展的主要机制之一。HDAC抑制剂,例如Panobinostat,Vorinostat和丙戊酸钠等,在临床前期研究中显示出抗GBM作用。尽管HDAC抑制剂抗肿瘤的确切机制尚未发现,但研究证实可能存在多种途径,包括诱导细胞周期停滞、分化、凋亡,自噬性细胞死亡,产生活性氧,抑制血管生成和DNA损伤修复(DNA damage repair,DDR)等。虽然临床前期研究中HDAC抑制剂的抗GBM作用效果明显,但初期临床试验中效果并不理想。因此需探索与HDAC抑制剂的联合用药方案以提高抗GBM疗效。本研究先通过在U87细胞用Panobinostat与PI3K/m TOR通路抑制剂或BET抑制剂进行组合药物筛选发现Panobinostat与JQ1或BEZ235对U87细胞生长有协同抑制,之后在多个GBM细胞系中进行验证,发现Panobinostat与JQ1或BEZ235联合应用能协同抑制GBM细胞生长及增殖,诱导凋亡,机制研究发现Panobinostat与BEZ235能够诱导更明显的p-AKT活性下降,Panobinostat与JQ1共同调节GBM细胞的基因表达。研究目的1、筛选与Panobinostat有协同效果的小分子抑制剂并进行验证2、探讨小分子抑制剂与Panobinsotat的协同机制技术方法1、通过Celltiter-Glo检测细胞活性方法观察Panobinostat与其他小分子抑制剂组合的协同效果2、通过Ed U方法检测联合用药对GBM细胞增殖的抑制作用6、通过Caspase-Glo方法检测联合用药对GBM细胞Caspse3/7的激活7、通过Cytotox-Glo方法检测联合用药对GBM细胞毒性作用8、通过Annexin-V/DAPI方法检测联合用药对GBM细胞凋亡的诱导作用9、通过q PCR,Western Blot,RNAseq等方法深入探讨联合用药抗GBM作用机制研究结果1、Panobinostat与BEZ235或BET抑制剂联合用药可协同抑制GBM细胞生长2、Panobinostat与BEZ235或JQ1联合用药对GBM细胞有更明显增殖抑制和凋亡诱导作用3、Panobinostat和JQ1联合用药共同下调GBM细胞肿瘤相关基因4、Panobinostat和JQ1联合用药共同上调GBM细胞肿瘤中抑癌及肿瘤代谢相关基因结论1、Panobinostat与BEZ235具有协同抗GBM作用2、Panobinostat与JQ1具有协同抗GBM作用