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背景及目的在我国,由癌症引起的死亡高居全国死亡率的第二位。其中,肝癌、胃癌分别位居癌症死亡率的第二、第三位。癌症的发病率在过去几十年中一直呈上升趋势,近年来明显加速,构成对人类生命安全的重大威胁!而且,人类在应对癌症特别是对癌症的有效诊治方面,仍有漫长的路要走。目前,针对胃癌、肝癌最有效的治疗方法仍是手术、化疗、放疗等方法,但这些方法仍有很多不足,如毒副作用大、复发率高、治愈率低。作为新兴的诊治手段,基因诊治在癌症的诊断、治疗及预后中具有显著的优势,有可能是未来癌症诊治的重要辅助手段。因此,对肿瘤相关基因功能的研究显得尤为重要。研究基因功能常用的手段有基因敲低(Inhibition/Knockdown)和基因敲除(Deletion/Knockout)。RNA干扰(RNAi)是最常用的基因敲低技术,已被广泛应用于与基因相关疾病的研究中。RNA干扰虽然对靶基因具有较高的抑制效率,但无法达到100%抑制,在基因功能研究方面存在一定的局限性,但技术简单,成本较低,易于成功,而基因敲除技术可以针对特定基因,使基因功能完全丧失,是一种更为可靠的基因研究手段。黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)在许多肿瘤中都过表达,其异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究利用RNAi技术,抑制FAK在人肝癌SMMC-7721、胃癌SGC-7901细胞内的表达,进而研究了FAK表达对肝癌、胃癌细胞表型及运动相关蛋白的影响。为深入探究FAK功能,以及为后续研究提供更确切的实验平台,本研究尝试了以TALEN技术构建FAK敲除的SGC-7901胃癌细胞系模型。方法一、FAK基因与胃癌、肝癌细胞恶性表型关系的研究1.利用磷酸钙转染法,将靶向FAK的干扰重组质粒转入SGC-7901、SMMC-7721细胞中。2.利用扫描电镜观察细胞形态及运动相关微结构。3.利用免疫荧光法、免疫细胞化学法及考马斯亮蓝染色对细胞骨架相关蛋白(F-actin、β-tubulin、Lamin B1)的表达、分布及重构进行研究。4.利用MitoViewTM 633、Hoechst 33342染色法检测线粒体膜电位、细胞核形态变化,EB染色法检测细胞膜通透性改变。二、利用TALEN构建FAK基因敲除的SGC-7901细胞系1.FAK基因组信息学分析,NCBI database中查找人类FAK基因组序列,找到CDS区,确定TALEN作用靶点位置。’2.根据TALEN设计原则,设计针对FAK的TALEN作用靶点位置识别序列。3.构建识别FAK基因敲除靶点的TALEN左右臂同源重组DNA质粒。4.靶细胞(胃癌细胞SGC-7901)培养及其转染(磷酸钙法)。5.连续稳定转染细胞的Puromycin(嘌呤霉素)抗性筛选。6. Puromycin筛选细胞的单克隆化(有限稀释法)及其扩大培养。7.阳性克隆的初步鉴定(细胞克隆FAK基因TALEN作用靶点序列的测定)。结果一、FAK基因与胃癌、肝癌细胞怒性表型关系的研究1.提取的FAK siRNA质粒浓度、纯度较好,对两种细胞的转染效率均≥80%。2.扫描电镜结果显示,FAK表达抑制后,细胞运动有关形态有所改变,片状、丝状伪足发育明显受到抑制,癌细胞最具特征的恶性表型—接触抑制丢失(Contact inhibition lost)有所恢复。3.FAK表达抑制后,F-actin表达减弱,微丝变细；由β-tubulin所形成的微管结构的Polymerization弱化；Lamin B1表达量降低,并呈时间依赖性。4.线粒体膜电位、细胞核形态有一定的变化,膜通透性改变不明显,FAK表达抑制对细胞凋亡的促进作用不明显。二、利用TALEN构建FAK基因敲除的SGC-7901细胞系1.酶切鉴定结果显示FAK基因敲除靶点的TALEN左右臂同源重组DNA质粒构建成功。2.质粒共转效率≥60%。3. Puromycin抗性筛选后,有限稀释法获得6株细胞克隆。4.对6株细胞克隆进行FAK基因组靶点序列测定,证明无FAK-/-SGC-7901克隆。结论1.FAK表达抑制可有效引起SMMC-7721、SGC-7901细胞运动相关微结构发育的抑制。这一改变对癌细胞侵袭、转移等癌症发展关键环节意义重大。2.FAK表达抑制与细胞凋亡的关系不明显。这与FAK基因的已知基本功能是相符的。3.本课题对FAK在癌细胞恶性表型方面的研究结果再次提示该基因的过表达对胃癌、肝癌发展过程的重要作用,提示FAK基因及其产物在胃癌、肝癌的基因诊治方面具有作为靶标的潜在性。4.以斯丹赛公司提供的TALEN试剂盒构建FAK基因敲除的SGC-7901细胞系未成功。结合行业内有关信息,以及本实验室另一尝试结果,说明该公司的该试剂盒不易于成功敲除靶基因。