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Exosome是由多种细胞分泌的一种纳米级囊泡,通过结合在受体细胞表面或进入受体细胞,参与许多重要的生理、病理过程。近年来,由于发现其在肿瘤免疫治疗中的重大价值,以及能在细胞间传递蛋白、mRNA、microRNA(miRNA)等活性物质,exosome正受到越来越多的关注。但是由于exosome的尺寸太小,用常规的方法很难直接观测,目前exosome与细胞相互作用的过程还不清楚,机理也不明确。相关的研究大多集中于exosome与细胞作用之后的分子鉴定,而对作用过程本身缺乏深入研究。例如,exosome进入受体细胞的方式存在很多争议。Exosome进入细胞后的运输,以及活性物质释放过程还很不清楚。关于exosome中含有的恶性miRNA等物质能否危害到受体细胞的问题,报道还很少。这些问题制约了exosome功能的研究,影响到在疾病预防、检测和治疗中的应用。本文的研究目标是发展各种高时、空分辨,高灵敏的检测技术,探讨exosome的提取、表征与标记等方法,研究细胞摄入exosome的过程与机理,以及exosome进入胞内的运输与命运,研究exosome对受体细胞的功能作用等,取得如下新性成果:
1、应用先进的光子学技术,建立了高灵敏和高分辨的单细胞检测平台,并用于直接观察exosome与细胞的相互作用。在高质量显微成像的基础上,发展了单粒子追踪技术和高通量显微术两种定量分析exosome与细胞作用的方法。该方法不仅能追踪exosome与单个细胞作用时的运动轨迹,获得exosome的动态参数和运动模式,还能一次获得大量细胞的高分辨图像,进而统计exosome与细胞相互作用的规律。
2、应用活细胞显微术和单粒子追踪技术对exosome与细胞作用过程进行了系统研究,结果表明:exosome在溶液中,细胞膜上和细胞内的运动模式有很大不同,分别是自由扩散,慢速漂移,以及限制性非常规运动和快速径直运动相交替的模式。发现exosome的蛋白成分在胞内从exosome的囊泡结构中释放出来,进入溶酶体,而脂质成分被运输到细胞膜上。
3、应用高通量显微术,系统地研究了exosome进入细胞的途径,结果表明:低温环境和细胞骨架的扰乱都会抑制exosome进入细胞。根据十八烷基罗丹明B标记exosome的实验结果,得出exosome是通过胞吞作用进入细胞。通过氯丙嗪、染料木黄酮、阿米洛利等药物抑制剂,以及使用siRNA干扰网格蛋白或凹陷蛋白,分别阻断细胞的网格蛋白依赖胞吞、凹陷蛋白依赖胞吞、以及大胞饮等途径,得出exosome经由网格蛋白介导的胞吞和大胞饮两种途径进入细胞。
4、通过PC12细胞的exosome对HeLa细胞和骨髓间充质干细胞(BMSC)的影响,深入研究了exosome介导miR-21所起的功能作用。结果表明:HeLa细胞在摄入PC12细胞来源的exosome之后,其细胞内PTEN的表达水平下降,而BMSC中的TGFβ RⅡ和STAT3的表达下降。通过miRNA抑制剂实验证实这些基因表达的下降与miR-21的传递有很大关联。结合定量PCR实验结果,表明PC12细胞来源的exosome能传递miR-21及其前体到HeLa细胞和BMSC。
综上所述,本论文系统研究了exosome与细胞作用过程的行为规律、摄入途径和功能作用,得到了有意义的结果,对exosome的细胞摄入,胞内运输以及最终命运提出了新的认识,初步证实了癌细胞来源的exosome能将恶性miRNA导入正常细胞或不同物种的细胞,分别影响不同靶基因的表达。文本的研究结果有助于深入理解exosome与细胞的相互作用,推动exosome功能的研究,以及在疾病预防、检测和治疗中的应用。