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乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,且在我国发病率呈逐年增高趋势。近年来对肿瘤相关基因的研究成为肿瘤研究的热点,通过对这些基因的研究有助于从根本上阐述肿瘤的发生、发展机制,从而寻找到肿瘤早期诊断的标记,有助于为肿瘤治疗寻找到新的方向。RNA干扰是一种在进化过程中发生的高度保守的、双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象;而RNA技术则是以这一现象的原理为基础发展起来的人工RNA干扰技术。应用RNA干扰技术可以高效、特异地沉默目的基因的表达,RNA干扰技术的一特点使其迅速发展成为基因功能研究的重要工具。目前,应用RNA干扰技术在体外乳腺癌细胞系中进行基因沉默,成为对乳腺癌相关基因功能研究的主要方法之一。COL1A1基因编码I型胶原纤维的前α链,有报道称其在乳腺癌中存在特异性表达,并且可能与乳腺癌的发生和转移存在一定相关性,课题前期实验通过Oligo基因芯片技术,比对各时期乳腺癌和正常乳腺组织发现,COL1A1基因可能在乳腺癌组织中过表达,可能是正常乳腺组织、乳腺原位癌、乳腺浸润癌的差异基因。但迄今为止,尚无人通过RNA干扰的方法明确其在乳腺癌发生、发展过程中的具体作用机制。本研究应用针对COL1A1基因设计的shRNA重组干扰质粒、通过真核细胞转染技术在脂质体2000介导下转染乳腺癌MCF-7细胞系,并对转染效率和抑制效率进行初步检验。最终成功转染了MCF-7细胞,并通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR方法对转染情况进行初步检验。结论如下:1.本实验将针对COL1A1基因设计的shRNA干扰质粒,在脂质体2000转染试剂介导下,体外成功转染于人乳腺癌MCF-7细胞系。2.本实验在荧光显微镜下观察COL1A1干扰质粒在乳腺癌MCF-7细胞中的转染效率为35%。3.本实验确定了转染后的MCF-7细胞G418药物筛选浓度为700μg/ml,并成功将转染后细胞进行筛选,阳性细胞数量大于90%。4.本实验通过实时荧光定量PCR方法,成功构建pMD18-T-β-actin和pMD18-T-COL1A1基因扩增的标准曲线对转染后细胞进行检测,发现COL1A1的mRNA水平明显下调,比对二条标准曲线的斜率后,应用相对定量2-△△Ct公式计算抑制效率为96.83% (P<0.05)。5.本实验成功优化了COL1A1基因干扰质粒的转染、筛选条件,成功验证了转染效率的检测方法,为后续实验继续研究COL1A1基因在乳腺癌细胞系MCF-7中的功能奠定基础。