烟草是我国重要的经济作物之一,而烟草病害是烟草生产上的重要问题,因此发掘抗病基因用于烟草遗传育种的研究,早在上世纪20年代已经开始。早期烟草抗病基因的筛选大多是通过个体水平上的抗性鉴定进行的,随着图位克隆尤其是植物基因组测序技术的发展,越来越多植物的抗病基因可以通过同源比对进行筛选鉴定。同时,目前RNA测序(RNA-seq)已成为进行基因表达和转录组分析的重要手段。本研究以普通烟草种红花大金元(N.tabacum,2n=4x=48)、野生种林烟草(N.sylvestris,2n=2x=24)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis, 2n=2x=24)、耳状烟草(N.otophora,2n=2x=24)等四个烟草种为供试材料,对开花时期的主要器官(根、茎、叶和花)进行了转录组测序与分析。对绒毛状烟草全基因组中NBS类基因进行了分析,明确了烟草NBS类抗病相关基因的数量及其类型、分布特征和系统发育学关系等。根据绒毛状烟草基因组抗病相关R基因的生物信息分析结果,选取其中的重要基因批量设计引物,利用GATEWAY表达载体构建方法,构建了高通量的烟草RNAi载体库。为进一步开展烟草抗病相关R基因的克隆及其功能的鉴定验证奠定了基础。主要研究结果如下:1.在转录水平上绒毛状烟草不同组织基因表达存在明显差异本研究首次采用转录组测序方法,对4个烟草种的4个器官进行了表达谱分析。结果发现,以绒毛状烟草基因组和基因集为参考,绒毛状烟草转录组数据分别有大约74%和59%的reads可以比对到基因组和基因区上,其中分别有43%和35%的reads能完全进行匹配。共有28 144个基因有转录组数据支持,数量占全部基因集的83.5%。通过转录组数据对预测基因进行了结构优化,并发现了很多新的转录本和可变剪切形式。采用RPKM法定量每个基因的表达水平,结果表明不同组织中的组织特异表达基因的数量差异很大,至少有1 642个基因存在组织特异性表达。其中,组织特异表达基因分布较多的器官是花,基因达到1 478个;在根、茎和叶组织中,特异表达的基因分别有866、179和165个。2.从绒毛状烟草基因集中筛选出282个含NBS结构的抗病基因根据绒毛状烟草测序结果,通过hmmer软件在绒毛状烟草基因集中预测得到282个含NBS结构的抗病基因。对获得的所有NBS类型R基因进行转录组数据的表达谱比较,结果表明在282个NBS类基因中共有154个基因具有转录组表达数据支持。其中,根、茎、叶和花中分别有145、134、129和132个基因有表达数据。有10多个基因在四个种的组织中都呈现高表达,说明这类R基因可能具有广谱抗性。此外,在林烟草、耳状烟草和普通烟草转录组数据中分别鉴定出220、247、320个序列含有NBS结构域。3.构建了绒毛状烟草NBS类抗病基因的系统进化树NBS类抗病基因的系统发生分析表明,进化树除了少数几个小的分支外,簇状大的分枝较为明显,基本上按照结构类别形成较大的簇状分枝,成簇基因在进化树末端聚在一起,可能是近期通过复制产生的,表现出更近的亲缘关系;也有部分基因呈单独分支存在,与类别存在差异,表明烟草抗病基因发生了较为复杂的进化过程。在绒毛状烟草基因组鉴定出的282个NBS类型抗病基因中,136个基因在染色体上的物理位置相近或相邻即形成基因簇。在形成的54个基因簇中,每个基因簇平均包含2.5个基因,最大的一个基因簇包含6个基因。共鉴定了11个hm同源基因,说明hm是一个多基因家族。4.利用GATEWAY表达载体构建法构建了高通量的烟草RNAi载体库在绒毛状烟草基因组抗病基因鉴定的基础上,根据已报道的抗病基因种类和烟草EST数据以及转录组数据的支持,我们从这些抗病基因中筛选出比较完整和可靠的候选基因共186个进行功能验证。利用GATEWAY表达载体构建方法,构建了高通量的烟草RNAi载体库。把186条R基因干扰片段的全部或部分连接到入门载体pDONR201中,用转化的克隆数评价烟草抗病R基因RNAi文库的容量,经计数分析,每微升初始库含有阳性克隆4.66×10~4 cfu,在200μL抗病R基因RNAi载体初始库中共有阳性克隆9.32×10~6 cfu,表明构建的表达载体库质量较高,为大规模研究R基因的功能和利用R基因打下了良好的基础。