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研究背景和目的大戟属(Euphorbia Linn)是大戟科(Euphorbiaceae)植物中最大的一个属。大戟属的很多植物是药用植物,大戟属植物的生物活性也多与其所含的二萜酯类(diterpenoids)密切相关。续随子(Euphorbia Lathyris Linn)为大戟属植物,在中国分布广泛,民间常用作除疣、抗肿瘤等。从续随子分离出一系列二萜类化合物,主要是续随烷型二萜,有较强的抗肿瘤和多药耐药抑制(multi-drug resistance, MDR)活性。续随二萜酯(euphorbiasteroid),又名大戟因子LI(Euphorbia factor L1)是从续随子分离得到的天然续随烷型二萜,对人宫颈癌HeLa细胞的增殖有显著抑制活性,对多种肿瘤耐药细胞株MCF-7/ADR、MES-SA/Dx5、KBV200等具有P-gp介导的多药耐药抑制活性。续随二萜酯在体外具有一定的抗HIV活性。本课题组的前期研究发现续随二萜酯对HIV感染的慢性H9细胞(H9/HIV-1ⅢB)与靶细胞MT2的融合有一定的抑制作用,测得半数抑制浓度IC5。和治疗指数T1分别为0.8μM、600。艾可清2号是广州中医药大学热带医学研究所在艾可清基础上研制的创新中药,由复方中药与续随二萜酯组合而成。实验研究表明艾可清2号能显著提升艾滋病恒河猴模型的CD4+T细胞比率及CD4+/CD8比值。创新中药复方艾可清2号显示了作为人类艾滋病治疗中药新药的应用前景。基于此,续随二萜酯有望成为既具有多药耐药抑制,又具有一定抗病毒能力的新型抗HIV先导化合物。到目前为止,有关续随二萜酯在体内的吸收、代谢等相关药代动力学特征尚不清楚。为满足新药的研究与开发需要,本课题对续随二萜酯在大鼠、中国恒河猴及猴艾滋病模型体开展了较为系统的药代动力学探索性研究。研究方法1.采用高效液相色谱/串联质谱联用(HPLC-MS/MS)定量分析方法,建立了生物样品中续随二萜酯的检测,用于续随二萜酯在大鼠、恒河猴、猴艾滋病模型体内药代动力学研究。2.通过Waters2767制备液相色谱仪分离,从续随二萜酯在碱作用下水解液得到环氧续随子醇。采用MS、1H-NMR、13C-NM等波谱学分析方法,鉴定了该化合物的结构。3.采用液相色谱-离子阱质谱联用(LC/MS”)技术,在多级质谱扫描模式下,分析了续随二萜酯在大鼠体内的代谢产物。4.采用超滤法进行了续随二萜酯与不同种属血浆蛋白结合率的研究。研究结果1.建立和确证了大鼠血浆、恒河猴血浆、猴艾滋病模型血浆等生物样品中续随二萜酯的液质联用(HPLC-MS/MS)定量分析方法。生物样品预处理采用乙酸乙酯液-液萃取,经Waters Symmetry Shield C8(4.6mm×150mm,5.0μm)色谱柱,流动相甲醇(A)-10mM含0.1%甲酸的甲酸铵水溶液(B)梯度洗脱。三重四极杆质谱仪进行多反应监测(MRM)模式下的电喷雾离子源正离子检测(ESI+),续随二萜酯和内标汉黄芩素用于定量分析离子对分别为m/z553→m/z297、m/z285→m/z270.标准曲线在1～10000μg·L-1范围内线性关系良好,线性相关系数r为0.9975；定量下限为1μg·L-1,续随二萜酯保留时间(tR)为4.0min,内标保留时间(tR)为4.3min,单个样品分析时间7.0min。日内、日间精密度(RSD)在2.6%-10.7%,准确度在1.6%～5.1%,符合生物样品分析的要求。2.考察了续随二萜酯在大鼠、恒河猴、猴艾滋病模型体内药动学特征。应用生物样品中续随二萜酯的HPLCMS/MS定量分析方法,考察了续随二萜酯大鼠单次口服给药和静注给药、恒河猴单次口服给药和静注给药及猴艾滋病模型口服给药的体内药物动力学特征,应用DAS2.1药动学对数据进行处理,得到非室模型药代动力学参数。续随二萜酯大鼠静脉注射10mg·kg-1,血药浓度极大值(Cmax)平均为3418.6μg·L-1,续随二萜酯大鼠口服给药100mg·kg-1,Cmax平均为87±32.4μg·L大鼠口服给药达峰时间平均为0.33h.续随二萜酯恒河猴静脉注射给药5mg·kg-1,Cmax平均为1359.5μg.L-1;口服给药30mg·kg-1,Cmax平均为139.1μg·L-1。恒河猴口服给药,达峰时间平均为0.31h。大鼠静和恒河猴静脉注射和口服给药后,续随二萜酯在体内均迅速衰减。药物在大鼠和恒河猴中都存在明显的个体差异。续随二萜酯猴艾滋病模型口服给药相同剂量,与正常恒河猴相比,血药浓度达到极大值为56.9μg.L-1,达峰时间平均为0.50h。续随二萜酯在恒河猴和猴艾滋病模型体内都存在明显的吸收差异性。大鼠、恒河猴、猴艾滋病模型口服给药绝对生物利用度分别为2.0%、4.6%、1.8%。相对于健康猴口服给药,猴艾滋病模型口服利用度约为1/3。3.续随二萜酯在THF中和50℃水浴温度下,经1.25mol·L-1NaOH作用48h,水解液经HPLC-DAD检测,液质联用多级质谱分析,Waters液相制备柱分离,得到一化合物纯品(得率5.42%),经电喷雾离子源正负离子质谱(ESI-MS)、13C-NMR,1H-NMR分析,鉴定为环氧续随子醇(epoxylathyrol)。4.应用电喷雾离子源多级质谱法分析了续随二萜酯的结构,并对它的裂解规律进行分析归纳。在正离子模式,利用离子阱质谱多级质谱扫描技术,对续随二萜酯在大鼠血液和尿液中的16个未知代谢产物进行了合理的推测。从续随二萜酯大鼠静注给药血样中推测了7个代谢产物可能的结构,代谢产物涉及酯酶水解成羟基,有的伴随羟基的甲基化,甲基加氧(0)氧化或者C-6环氧加氢(H)还原。从续随二萜酯大鼠口服给药血样中推测了5个代谢产物可能的结构,其中4个与静注给药血样中代谢产物相同。大鼠血样中的代谢产物以Ⅰ相代谢为主,而尿液中的代谢产以Ⅱ相代谢为主。从续随二萜酯大鼠口服给药尿样中推测了4个代谢产物结构。尿样中的代谢产物除少量酯酶水解产物,大部分是与葡萄糖醛酸结合产物,有些还伴有甲基化。5.采用超滤法、Amicon Ultra-0.5超滤离心装置(截留分子量10K)对续随二萜酯与三种属(SD大鼠、恒河猴、人)血浆蛋白结合程度进行研究。续随二萜酯磷酸缓冲盐溶液非特性结合率平均为60.5%。在三个浓度水平(1000、100、20μg·L-1)条件下,续随二萜酯与大鼠、猴、人血浆蛋白结合率均较高(76.0%、98.0%),与血浆蛋白的结合不存在浓度依赖性。续随二萜酯与大鼠血浆蛋白结合率相对较低(76.0%～79.8%),与恒河猴、人血浆蛋白结合率较高(94.6%～98.0%),续随二萜酯与人和猴血浆蛋白结合率无统计学差异(p>0.05)。考虑到高非特异性结合率,对血浆蛋白结合率进行校正后,续随二萜酯与人和猴血浆蛋白结合率均高于86%。结论和创新点1.建立和确证了生物样品中续随二萜酯在ESI电离源、MRM模式下液质联用定量分析方法。血样最低定量限1μg·L-1,线性范围1-10000μg· L-1,适用于动物口服给药和静注给药后血浆样品中药物的检测。应用液质联用方法,首次研究比较了续随二萜酯在大鼠、健康及猴艾滋病模型中国恒河猴体内的药代动力学特征。发现大鼠与恒河猴口服给药后,血药浓度达峰时间均约0.3-0.5h。给药后,续随二萜酯血药浓度在体内均发生迅速衰减；生物利用度均很低,大鼠、恒河猴或其艾滋病模型的绝对生物利用度均低于5.0%,提示提高生物利用度对于给药可能具有关键意义。2.首次从续随二萜酯制备环氧续随子醇。水解过程采用液质谱联用(LC-DAD/ESI-MS")技术监控。3.利用液相色谱-离子阱质谱联用(LC/MSn)技术,对续随二萜酯在大鼠血液和尿液中,16个未知代谢产物的结构进行了合理的推测。4.首次应用超滤法测定了续随二萜酯与大鼠、恒河猴、人血浆蛋白结合率。续随二萜酯与恒河猴、人血浆蛋白结合率(94.6%、98.0%)高于与大鼠血浆蛋白结合率(76.0%～79.8%)。续随二萜酯对人和猴血浆蛋白的结合率无统计学差异(p>0.05)。对非特异性结合进行校正后,续随二萜酯与恒河猴、人血浆蛋白结合率仍大于86%。