米发糕发酵过程中,在微生物作用下,蛋白质降解为多肽等具有抗氧化活性的物质。微生物的不同酶系对蛋白质的作用位点不同,影响多肽结构。经胃肠消化后,蛋白质和多肽进一步降解,产生复杂的抗氧化多肽体系。目前对肽的结构、活性、及高活性肽的控制尚不清楚。本实验以四种不同组合的发酵剂发酵制作米发糕,研究发酵剂对米发糕消化产物组成及活性的影响,并通过超滤、反相液相色谱分离纯化抗氧化肽,采用液质联用法鉴定其氨基酸序列结构,通过肽组学与抗氧化肽构效关系结合的方法筛选高抗氧化活性肽。探索产生抗氧化作用的机制,为筛选高抗氧化活性优势菌提供依据。主要研究内容和结论如下:1.米发糕胃肠水解物抗氧化物质组成及活性米发糕胃消化物DPPH·清除能力、·OH清除能力、还原能力与水提物相比显著提高;进一步用胰酶消化后,有不同程度的提高或下降。米发糕经胃和胃肠消化后,Fe2+鳌合能力均显著提高。米发糕胃肠水解物中的可溶性蛋白质和可溶性肽的还原能力和对清除·OH作用最强,蛋白质、游离氨基酸和可溶性糖对螯合Fe2+作用最强。DPPH·清除能力与蛋白质、多肽、氨基酸、可溶性糖含量相关性不大。氨基酸对抗氧化能力的作用大小为碱性氨基酸＞酸性氨基酸＞疏水性氨基酸。2.米发糕发酵剂抗氧化活肽的特异性经胃肠消化后,酵母菌和根霉菌制作的米发糕的DPPH·清除率最高（49.9%）;酵母菌和乳酸菌制作的米发糕的OH自由基能力（31.78%）、还原能力最强;Fe2+鳌合能力最强的是安琪酵母和酒曲制作的米发糕（13.11%）。选择酵母菌和乳酸菌、酵母菌和米根霉作为发酵剂,可制作抗氧化活性较高的米发糕。采用凝胶色谱法对米发糕消化前后产物进行了分子量的测定,发现四种米发糕胃肠水解产物的分子量主要集中在＜3KDa范围内。抗氧化活性与分子量大小有一定关系,大分子量（＞10KDa）的物质对DPPH自由基有较强的清除作用,而小于3KDa的多肽或游离氨基酸表现出较强的亚铁离子螯合能力。其中酵母菌和乳酸菌米发糕组分Ⅲ还原能力最强。采用高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪鉴定分析了米发糕消化前后产物的肽段差异。酵母菌和乳酸菌米发糕水提物的肽段最多,检测到1868个肽段。经过胃肠消化后,其可检测到的肽段数相对减少。酵母乳酸、酵母根霉、安琪酵母酒曲米发糕的肽段相似程度高。3.米发糕高抗氧化活性水解肽的结构及序列根据抗氧化肽构效关系,从酵母菌和乳酸菌米发糕超滤组分中筛选出RLDGIPPAPR、YPMYPLPR、DFGSEILPR并合成验证。多肽RLDGIPPAPR、YPMYPLPR对DPPH自由基清除作用较强,而OH自由基清除率和Fe2+螯合能力较低。结果表明通过超滤分离得到的肽段复杂且数量很多,仅根据抗氧化肽构效关系来筛选抗氧化活性肽难以达到目的,需要进一步分离纯化。经过反相高效液相色谱继续分离,分别测定了各组分的抗氧化活性,发现组分F14、F15、F16、F17活性较高。采用TOF LC-MS/MS质谱仪鉴定其肽段序列,通过Peptide Ranker数据库对肽段序列进行预测活性评分,并用Uniprot数据库分析肽段所属蛋白质的功能活性。结合抗氧化肽构效关系推测可能具有抗氧化活性的肽并合成验证。结果表明,WLSYPMNPATGH具有良好的Fe2+螯合能力和一定的自由基清除能力,PRPPKPDAPR具有良好的Fe2+螯合能力。表明此方法准确性较高。